İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi
Summary
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.
Abstract
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyolojik dokuların doğal mikro ortamında içsel moleküler titreşime dayalı etiketsiz görüntülenmesini sağlar, böylece hücresel altı çözünürlükte biyolojik süreçlerin in vivo çalışması için mükemmel bir araç sağlar. İki foton uyarılmış floresan (TPEF) görüntülemeyi SRS mikroskobuna entegre ederek, dokuların çift modal in vivo görüntülemesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamaya yardımcı olan çoklu perspektiflerden kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgiler elde edebilir. Bu video protokolünde, bir TPEF-SRS mikroskop sisteminin kurulması ve hayvan omuriliğinin in vivo görüntüleme yöntemi tanıtılmaktadır. Omurilik, merkezi sinir sisteminin bir parçası olarak, beyin ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişimde kritik bir rol oynar. Fosfolipitlerde bol miktarda bulunan miyelin kılıfı, aksiyon potansiyellerinin tuzlayıcı iletimine izin vermek için aksonu çevreler ve yalıtır. Omurilikteki miyelin kılıfların in vivo görüntülenmesi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik hasarının ilerlemesini incelemek için önemlidir. Protokol ayrıca hayvan hazırlama ve yüksek çözünürlüklü biyolojik görüntüler elde etmek için in vivo TPEF-SRS görüntüleme yöntemlerini de tanımlamaktadır.
Introduction
Raman mikroskobu1,2, biyomoleküllerdeki çeşitli kimyasal bağların karakteristik frekanslarına dayanarak biyolojik dokuları görüntülemek için güçlü bir etiketsiz yöntem olarak ortaya çıkmaktadır. Non-invaziv ve iyi uyarlanabilir görüntüleme kabiliyeti sayesinde Raman mikroskopisi, miyelin kılıfı3,4,5, adipositler6,7 ve lipit damlacıkları gibi biyolojik dokulardaki lipitle zenginleştirilmiş bileşenleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılmaktadır8,9,10 . Uyarılmış Raman kazancı (SRG) veya uyarılmış Raman kaybı (SRL) olarak elde edilen uyarılmış Raman saçılması (SRS) sinyali arka plansızdır ve spontan Raman saçılmasına mükemmel spektral benzerlik gösterir11,12. Ek olarak, SRL ve SRG, analit konsantrasyonuna doğrusal olarak bağımlıdır ve biyokimyasal bileşenlerin kantitatif analizine izin verir9,11,13. İki foton uyarılmış floresan mikroskobu (TPEF), doğal optik kesitleme yeteneği, derin penetrasyon derinliği ve düşük fototoksisitesi nedeniyle in vivo biyolojik görüntüleme için yaygın olarak kullanılmaktadır14,15,16. Bununla birlikte, TPEF görüntülemenin performansı floresan etiketlerin özelliklerine bağlıdır ve geniş bant floresan spektrumları nedeniyle çözülebilir renklerin sayısı sınırlıdır8,17,18,19. Etiketsiz SRS görüntüleme ve floresan bazlı TPEF görüntüleme iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemidir ve bunların kombinasyonu dokuların bol miktarda biyofiziksel ve biyokimyasal bilgisini sağlayabilir. Bu iki görüntüleme yönteminin her ikisi de, tek bir mikroskop sistemine basit entegrasyona izin veren doğrusal olmayan optik (NLO) işlemlere dayanmaktadır. SRS ve TPEF görüntülemenin kombinasyonu, sözde çift modal görüntüleme, hücrelerin ve dokuların yüksek boyutlu görüntülenmesini ve profillenmesini sağlayarak karmaşık biyolojik sistemlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır. Spesifik olarak, pikosaniye (ps) SRS mikroskopisi, femtosaniye (fs) SRS tekniğine11 kıyasla yüksek spektral çözünürlükte kimyasal bağ görüntülemesi elde edebilir ve biyolojik dokuda, özellikle kalabalık parmak izi bölgesinde20,21 çoklu biyokimyasal bileşenleri ayırt etmeyi sağlar. Ek olarak, tutarlı anti-Stokes saçılma (CARS) mikroskobunun entegrasyonu ile yaygın olarak kullanılan bir başka çift modlu NLO mikroskop sistemi ile karşılaştırıldığında, SRS, spektral ve görüntü yorumlamanın yanı sıra algılama hassasiyeti açısından CARS’a üstün performans göstermektedir11. SRS-TPEF mikroskobu, Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kurbağa yavrusu beyni5, fare beyni23,24, omurilik25,26, periferik sinir27 ve yağ dokusu7 gibi çeşitli biyolojik sistemleri incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır.
Omurilik, beyin ile birlikte merkezi sinir sistemini (CNS) oluşturur. Fizyolojik ve patolojik koşullar altında CNS’deki hücresel aktiviteleri in vivo olarak görselleştirmek, CNS bozukluklarının mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir28,29,30 ve buna karşılık gelen tedavilerin geliştirilmesi31,32,33. Yüksek hızlı aksiyon potansiyeli iletimi için aksonları saran ve yalıtan miyelin kılıf, CNS’nin gelişiminde önemli bir rol oynar. Demiyelinasyon, multipl skleroz gibi beyaz cevher bozukluklarında bir ayırt edici özellik olarak düşünülmektedir34. Ek olarak, omurilik yaralanmasından35 sonra, miyelin kalıntıları makrofaj aktivasyonunu modüle ederek kronik inflamasyona ve ikincil yaralanmaya katkıda bulunabilir36. Bu nedenle, canlı fare modellerinde nöronlar ve glial hücrelerle birlikte miyelin kılıfın in vivo görüntülenmesi, CNS bozukluklarındaki dinamik süreçleri anlamada büyük yardımcı olmaktadır.
Bu protokolde, ev yapımı bir TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulum prosedürleri tanımlanmış ve fare omuriliği için çift modlu in vivo görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulumu ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. SRS görüntüleme için, pompa ve Stokes kirişleri OPO’nun içinde geçici ve uzamsal olarak üst üste biner. Bununla birlikte, bu örtüşme mikroskop sisteminden geçtikten sonra bozulabilir. Bu nedenle, pompanın ve Stokes ışınlarının kolokalizasyonunun hem mekansal hem de zamansal optimizasyonu, optimum SRS görüntülemeyi elde etmek için gerekli ve kritiktir. Pompa ve Stokes ışını arasındaki zamansal gecikme,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi tarafından 16103215, 16148816, 16102518 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu (ITCPD/17-9), Üniversite Hibeleri Komitesi Mükemmellik Programı Alanı (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) ve Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (HKUST) tarafından RPC10EG33 hibesi yoluyla desteklenmiştir.
Materials
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
References
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
- Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
- Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
- Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
- Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
- Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
- He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
- Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
- Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
- Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
- Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
- Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
- Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
- Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
- Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
- van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
- Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
- Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
