In vivo Визуализация биологических тканей с помощью комбинированной двухфотонной флуоресценции и стимулированной рамановской рассеянной микроскопии
Summary
Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) позволяет безметочно визуализировать биомолекулы на основе их внутренней вибрации определенных химических связей. В этом протоколе описана инструментальная установка интегрированного SRS и двухфотонного флуоресцентного микроскопа для визуализации клеточных структур в спинном мозге живых мышей.
Abstract
Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) позволяет безметочно визуализировать биологические ткани в их естественном микроокружении на основе внутренней молекулярной вибрации, обеспечивая тем самым идеальный инструмент для изучения in vivo биологических процессов с субклеточным разрешением. Интегрируя двухфотонную возбужденную флуоресцентную (TPEF) визуализацию в микроскоп SRS, двухмодальная визуализация тканей in vivo может получать критически важную биохимическую и биофизическую информацию с нескольких точек зрения, которая помогает понять динамические процессы, участвующие в клеточном метаболизме, иммунном ответе и ремоделировании тканей и т. Д. В этом видеопротоколе вводится настройка системы микроскопа TPEF-SRS, а также метод визуализации спинного мозга животных in vivo . Спинной мозг, как часть центральной нервной системы, играет решающую роль в коммуникации между головным мозгом и периферической нервной системой. Миелиновая оболочка, богатая фосфолипидами, окружает и изолирует аксон, чтобы обеспечить солевую проводимость потенциалов действия. Визуализация in vivo миелиновых оболочек в спинном мозге важна для изучения прогрессирования нейродегенеративных заболеваний и травм спинного мозга. Протокол также описывает препараты животных и методы визуализации in vivo TPEF-SRS для получения биологических изображений с высоким разрешением.
Introduction
Рамановская микроскопия1,2 становится мощным методом без меток для изображения биологических тканей на основе характерных частот различных химических связей в биомолекулах. Благодаря своей неинвазивной и хорошо адаптивной способности к визуализации, рамановская микроскопия широко используется для визуализации обогащенных липидами компонентов в биологических тканях, таких как миелиновая оболочка3,4,5, адипоциты6,7 и липидные капли8,9,10 . Сигнал стимулированного комбинационного рассеяния (SRS), полученный в виде стимулированного комбинационного усиления (SRG) или стимулированного рамановского рассеяния (SRL), не имеет фона, показывая идеальное спектральное сходство со спонтанным комбинационным рассеянием11,12. Кроме того, SRL и SRG линейно зависят от концентрации анализируемого вещества, что позволяет проводить количественный анализ биохимических компонентов9,11,13. Двухфотонная возбужденная флуоресцентная микроскопия (TPEF) широко используется для биологической визуализации in vivo благодаря присущей ей способности к оптическому сечению, глубине глубокого проникновения и низкой фототоксичности14,15,16. Однако производительность визуализации TPEF зависит от характеристик флуоресцентных меток, а количество разрешимых цветов ограничено из-за широкополосных флуоресцентных спектров8,17,18,19. Визуализация SRS без меток и флуоресцентная визуализация TPEF являются двумя взаимодополняющими методами визуализации, и их комбинация может обеспечить обильную биофизическую и биохимическую информацию тканей. Эти два метода визуализации основаны на нелинейных оптических (NLO) процессах, что позволяет легко интегрировать их в одну систему микроскопа. Сочетание визуализации SRS и TPEF, так называемой двойной модальной визуализации, позволяет проводить многомерную визуализацию и профилирование клеток и тканей, способствуя всестороннему пониманию сложных биологических систем. В частности, пикосекундная (ps) SRS-микроскопия может достигать визуализации химических связей с высоким спектральным разрешением по сравнению с фемтосекундным (fs) методом SRS11, что позволяет дифференцировать несколько биохимических компонентов в биологической ткани, особенно в переполненной области отпечатков пальцев20,21. Кроме того, по сравнению с другой широко используемой двухмодальной системой микроскопа NLO с интеграцией когерентного микроскопа рассеяния против Стокса (CARS), SRS демонстрирует превосходную производительность по сравнению с CARS с точки зрения спектральной интерпретации и интерпретации изображений, а также чувствительности обнаружения11. Микроскоп SRS-TPEF использовался в качестве мощного инструмента для изучения различных биологических систем, таких как Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis головастик brain5, мозг мыши23,24, спинной мозг25,26, периферический нерв27 и жировая ткань7 и т.д.
Спинной мозг вместе с головным мозгом составляет центральную нервную систему (ЦНС). Визуализация клеточной активности в ЦНС in vivo при физиологических и патологических состояниях имеет решающее значение для понимания механизмов расстройств ЦНС28,29,30 и для разработки соответствующих методов лечения31,32,33. Миелиновая оболочка, которая оборачивает и изолирует аксоны для высокоскоростной проводимости потенциала действия, играет значительную роль в развитии ЦНС. Демиелинизация считается отличительной чертой при расстройствах белого вещества, таких как рассеянный склероз34. Кроме того, после травмы спинного мозга35 обломки миелина могут модулировать активацию макрофагов, способствуя хроническому воспалению и вторичному повреждению36. Поэтому визуализация in vivo миелиновой оболочки вместе с нейронами и глиальными клетками в живых мышиных моделях очень помогает понять динамические процессы при нарушениях ЦНС.
В этом протоколе описываются фундаментальные процедуры настройки домашнего микроскопа TPEF-SRS и представлены методы двойной модальной визуализации in vivo для спинного мозга мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе подробно описана базовая настройка микроскопа TPEF-SRS. Для визуализации SRS пучки насоса и Стокса временно и пространственно перекрываются внутри OPO. Однако это перекрытие может быть нарушено после прохождения через систему микроскопа. Поэтому как пространственная, так и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Советом по исследовательским грантам Гонконга посредством грантов 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Комиссии по инновациям и технологиям (ITCPD/17-9), Схемы области передового опыта Комитета по университетским грантам (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) и Гонконгского университета науки и технологии (HKUST) через грант RPC10EG33.
Materials
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
References
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
- Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
- Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
- Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
- Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
- Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
- He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
- Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
- Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
- Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
- Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
- Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
- Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
- Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
- Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
- van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
- Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
- Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
