מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.
מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של הרקמות הביולוגיות במיקרו-סביבה הטבעית שלה המבוססת על רטט מולקולרי מהותי, ובכך מספקת כלי מושלם לחקר vivo של תהליכים ביולוגיים ברזולוציה תת-תאית. על ידי שילוב הדמיית פלואורסצנטיות נרגשת דו-פוטונית (TPEF) במיקרוסקופ SRS, הדו-מודאלי בהדמיית vivo של רקמות יכול לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי מנקודות מבט מרובות המסייעות בהבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות וכו ‘. בפרוטוקול וידאו זה, ההתקנה של מערכת מיקרוסקופ TPEF-SRS, כמו גם את שיטת הדמיית in vivo של חוט השדרה החייתי הוא הציג. חוט השדרה, כחלק ממערכת העצבים המרכזית, ממלא תפקיד קריטי בתקשורת בין המוח למערכת העצבים ההיקפית. נדן מיאלין, השופע בפוספוליפידים, מקיף ומבודד את האקסון כדי לאפשר הולכה מלוחה של פוטנציאל פעולה. בהדמיית vivo של נדן מיאלין בחוט השדרה חשוב ללמוד את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה. הפרוטוקול מתאר גם הכנה לבעלי חיים ושיטות הדמיה של vivo TPEF-SRS לרכישת תמונות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה.
ראמאן מיקרוסקופיה1,2 מתגלה כשיטה רבת עוצמה ללא תוויות לדמות רקמות ביולוגיות המבוססות על התדרים האופייניים של קשרים כימיים שונים בביומולקולות. הודות ליכולת ההדמיה הלא פולשנית והמסתגלת היטב שלה, המיקרוסקופיה של ראמאן נמצא בשימוש נרחב להדמיית רכיבים מועשרים בשומנים ברקמות ביולוגיות כמו נדן מיאלין3,4,5, אדיפוציטים6,7 וטיפות שומנים בדם8,9,10 . אות פיזור ראמאן מגורה (SRS) שנרכש כרווח ראמאן מגורה (SRG) או אובדן ראמאן מגורה (SRL) הוא ללא רקע, מראה דמיון ספקטרלי מושלם פיזור ראמאן ספונטני 11,12. בנוסף, SRL ו- SRG תלויים באופן ליניארי בריכוז הניתוח, ומאפשרים ניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים9,11,13. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נרגשת דו-פוטונית (TPEF) נמצאת בשימוש נרחב להדמיה ביולוגית in vivo בשל יכולת החתך האופטית הטבועה בה, עומק החדירה העמוק והפוטוטוקסיות הנמוכה14,15,16. עם זאת, הביצועים של הדמיית TPEF תלויים במאפיינים של תגים פלואורסצנטיים, ומספר הצבעים הפתירים מוגבל עקב ספקטרום פלואורסצנטיות בפס רחב8,17,18,19. הדמיית SRS ללא תוויות והדמיה מבוססת פלואורסצנטיות TPEF הן שתי שיטות הדמיה משלימות, והשילוב ביניהן יכול לספק מידע ביופיסי וביוכימי בשפע של רקמות. שתי שיטות הדמיה אלה מבוססות שתיהן על התהליכים האופטיים הלא ליניאריים (NLO), המאפשרים אינטגרציה פשוטה במערכת מיקרוסקופ אחת. השילוב של הדמיית SRS ו- TPEF, מה שמכונה הדמיה דו-מודאלית, מאפשר הדמיה ופרופילים ממדיים גבוהים של תאים ורקמות, ומאפשר הבנה מקיפה של מערכות ביולוגיות מורכבות. באופן ספציפי, picosecond (ps) מיקרוסקופיה SRS יכול להשיג הדמיה כימית-קשר עם רזולוציה ספקטרלית גבוהה לעומת femtosecond (fs) SRS טכניקה11, המאפשר להבדיל בין רכיבים ביוכימיים מרובים ברקמה ביולוגית, במיוחד באזור טביעת האצבע הצפוף20,21. בנוסף, בהשוואה למערכת מיקרוסקופית אחרת של NLO הדו-מודאלית הנפוצה עם שילוב של מיקרוסקופ פיזור אנטי-סטוקס קוהרנטי (CARS), SRS מציג ביצועים מעולים למכוניות במונחים של פרשנות ספקטרלית ותמונה, כמו גם רגישות לזיהוי11. המיקרוסקופ SRS-TPEF שימש ככלי רב עוצמה לחקר מערכות ביולוגיות שונות, כגון Elegans Caenorhabditis9,22, מוח ראשן קסנופוס laevis5, מוח עכבר23,24, חוט השדרה25,26, עצב היקפי27, רקמת שומן7, וכו ‘.
חוט השדרה יחד עם המוח מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית (CNS). הדמיית הפעילות התאית במערכת העצבים המרכזית במערכת העצבים המרכזית ב-vivo בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים היא קריטית להבנת המנגנונים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית28,29,30 ולפיתוח טיפולים מקבילים31,32,33. נדן מיאלין, העוטף ומבודד אקסונים להולכה פוטנציאלית של פעולה במהירות גבוהה, ממלא תפקיד משמעותי בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. Demyelination נחשב כסימן היכר בהפרעות חומר לבן, כגון טרשת נפוצה34. בנוסף, לאחר פגיעה בחוט השדרה35, פסולת מיאלין יכולה לווסת את הפעלת המקרופאג ‘, התורמת לדלקת כרונית ולפציעה משנית36. לכן, בהדמיית vivo של נדן מיאלין יחד עם נוירונים ותאי גליה במודלים של עכבר חי הוא לעזר רב להבין את התהליכים הדינמיים בהפרעות במערכת העצבים המרכזית.
בפרוטוקול זה מתוארים הליכי ההתקנה הבסיסיים של מיקרוסקופ TPEF-SRS ביתי ומוכנסים המודאליות הכפולות בשיטות הדמיית vivo לחוט השדרה של העכבר.
בפרוטוקול זה, ההתקנה הבסיסית של מיקרוסקופ TPEF-SRS מתוארת בפירוט. עבור הדמיית SRS, המשאבה וקורות סטוקס חופפות זמנית ומרחבית בתוך OPO. עם זאת, חפיפה זו יכולה להיות משובשת לאחר שעבר דרך מערכת המיקרוסקופ. לכן, הן אופטימיזציה מרחבית והן אופטימיזציה זמנית של colocalization של המשאבה וקורות סטוקס הוא הכרחי ו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת מענקי המחקר של הונג קונג באמצעות מענקים 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, ועדת החדשנות והטכנולוגיה (ITCPD/17-9), תחום תוכנית המצוינות של ועדת המענקים של האוניברסיטה (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12), ואוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) באמצעות מענק RPC10EG33.
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |