In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Summary

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

Abstract

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des tissus biologiques dans son microenvironnement naturel basée sur la vibration moléculaire intrinsèque, fournissant ainsi un outil parfait pour l’étude in vivo des processus biologiques à résolution subcellulaire. En intégrant l’imagerie par fluorescence excitée à deux photons (TPEF) dans le microscope SRS, l’imagerie in vivo bimodale des tissus peut acquérir des informations biochimiques et biophysiques critiques à partir de multiples perspectives qui aident à comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus, etc. Dans ce protocole vidéo, la configuration d’un système de microscope TPEF-SRS ainsi que la méthode d’imagerie in vivo de la moelle épinière animale sont introduites. La moelle épinière, en tant que partie du système nerveux central, joue un rôle essentiel dans la communication entre le cerveau et le système nerveux périphérique. La gaine de myéline, abondante en phospholipides, entoure et isole l’axone pour permettre la conduction saltatoire des potentiels d’action. L’imagerie in vivo des gaines de myéline dans la moelle épinière est importante pour étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière. Le protocole décrit également la préparation animale et les méthodes d’imagerie TPEF-SRS in vivo pour acquérir des images biologiques à haute résolution.

Introduction

La microscopie ^Raman1,2 est en train de devenir une puissante méthode sans étiquette pour imager les tissus biologiques en fonction des fréquences caractéristiques de diverses liaisons chimiques dans les biomolécules. En raison de sa capacité d’imagerie non invasive et bien adaptative, la microscopie Raman a été largement utilisée pour l’imagerie de composants enrichis en lipides dans des tissus biologiques tels que la gaine de myéline3,4,5, les adipocytes6,7 et les gouttelettes lipidiques8,9,10 . Le signal de diffusion Raman stimulée (SRS) acquis sous forme de gain Raman stimulé (SRG) ou de perte Raman stimulée (SRL) est sans arrière-plan, montrant une ressemblance spectrale parfaite avec la diffusion Raman ^{spontanée11,12}. De plus, le SRL et le SSR dépendent linéairement de la concentration de l’analyte, ce qui permet une analyse quantitative des composants biochimiques9,11,13. La microscopie à fluorescence excitée à deux photons (TPEF) a été largement utilisée pour l’imagerie biologique in vivo en raison de sa capacité de sectionnement optique inhérente, de sa profondeur de pénétration profonde et de sa faible phototoxicité14,15,16. Cependant, les performances de l’imagerie TPEF dépendent des caractéristiques des étiquettes fluorescentes, et le nombre de couleurs résolvables est limité en raison des spectres de fluorescence à large bande8,17,18,19. L’imagerie SRS sans étiquette et l’imagerie TPEF basée sur la fluorescence sont deux modalités d’imagerie complémentaires, et leur combinaison peut fournir des informations biophysiques et biochimiques abondantes sur les tissus. Ces deux modalités d’imagerie sont toutes deux basées sur les processus optiques non linéaires (NLO), ce qui permet une intégration simple dans un système de microscope. La combinaison de l’imagerie SRS et TPEF, appelée imagerie dual-modale, permet l’imagerie et le profilage de haute dimension des cellules et des tissus, facilitant ainsi une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Plus précisément, la microscopie SRS picoseconde (ps) permet d’obtenir une imagerie de liaison chimique avec une résolution spectrale élevée par rapport à la technique SRS femtoseconde (fs)¹¹, permettant de différencier plusieurs composants biochimiques dans les tissus biologiques, en particulier dans la région d’empreintes digitales ^{encombrée20,21}. En outre, par rapport à un autre système de microscope NLO bimodal couramment utilisé avec intégration d’un microscope à diffusion anti-Stokes cohérente (CARS), SRS montre des performances supérieures à CARS en termes d’interprétation spectrale et d’image ainsi que de sensibilité de ^détection11. Le microscope SRS-TPEF a été utilisé comme un outil puissant pour étudier divers systèmes biologiques, tels que Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole ^brain5, cerveau de ^souris23,24, moelle ^{épinière25,26}, nerf ^{périphérique27} et tissu adipeux7, etc.

La moelle épinière et le cerveau constituent le système nerveux central (SNC). La visualisation des activités cellulaires dans le SNC in vivo dans des conditions physiologiques et pathologiques est essentielle pour comprendre les mécanismes des troubles du ^SNC28,29,30 et pour développer des thérapies correspondantes31,32,33. La gaine de myéline, qui enveloppe et isole les axones pour une conduction potentielle d’action à grande vitesse, joue un rôle important dans le développement du SNC. La démyélinisation est considérée comme une caractéristique dans les troubles de la substance blanche, tels que la sclérose en ^plaques34. De plus, après une lésion de la moelle ^épinière35, les débris de myéline peuvent moduler l’activation des macrophages, contribuant ainsi à l’inflammation chronique et aux lésions ^{secondaires36}. Par conséquent, l’imagerie in vivo de la gaine de myéline avec les neurones et les cellules gliales dans des modèles murins vivants est d’une grande aide pour comprendre les processus dynamiques dans les troubles du SNC.

Dans ce protocole, les procédures de configuration fondamentales d’un microscope TPEF-SRS construit à la maison sont décrites et les méthodes d’imagerie in vivo bimodales pour la moelle épinière de souris sont introduites.

Protocol

Toutes les procédures animales effectuées dans ce travail sont menées conformément aux directives du Laboratory Animal Facility de l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de HKUST. Une formation à la sécurité pour la manipulation laser est nécessaire pour configurer et utiliser le microscope TPEF-SRS. Portez toujours des lunettes de sécurité laser avec une plage de longueurs d’onde appropriée lorsque vous traitez avec un l…

Representative Results

L’imagerie bimodale in vivo des axones de la colonne vertébrale ainsi que des gaines de myéline est réalisée à l’aide de souris transgéniques Thy1-YFPH, qui expriment l’EYFP dans les neurones afférents des ganglions de la racine dorsale (Figure 3). Ces neurones afférents marqués relaient l’information sensorielle du nerf périphérique à la moelle épinière, la branche centrale étant située dans la colonne dorsale de la moelle épinière. Avec le microscope TPEF…

Discussion

Dans ce protocole, la configuration de base du microscope TPEF-SRS est décrite en détail. Pour l’imagerie SRS, la pompe et les faisceaux stokes se chevauchent temporellement et spatialement à l’intérieur de l’OPO. Cependant, ce chevauchement peut être perturbé après le passage dans le système de microscope. Par conséquent, l’optimisation spatiale et temporelle de la colocalisation de la pompe et des faisceaux de Stokes est nécessaire et essentielle pour obtenir une imagerie SRS optimale. Le délai temp…

Materials

#2 Forceps	Dumont	11223-20	For laminectomy
10X objective	Nikon	CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective	Olympus	XLPLN25XSVMP2
Burn cream	Betadine
Camera	Sony	α6300
Current amplifier	Stanford research	SR570
Current photomultiplier modules	Hamamatsu	H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror	Semrock	FF665-Di02-25×36	For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror	Edmund	69-206	For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream	Veet
FS1 975 nm short-pass filter	Edmund	86-108	For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter	Semrock	FF01-850/310	For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter	Semrock	FF01-525/50	For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter	Semrock	FF01-715/SP-25	For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate	Thorlabs	SAHWP05M-1700
High-speed photodetector	MenloSystems	FPD 310-F	For checking Stokes beam modulation
Iodine	Betadine
IR Scope	FJW	FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris	Thorlabs	CPA1
L1	Thorlabs	AC254-060-B-ML
L10	Thorlabs	LA4052-A
L2	Thorlabs	LA1422-B
L3	Thorlabs	AC254-050-B
L4	Thorlabs	AC254-060-B-ML
L7			f=100 mm, AB coating
L8	Thorlabs	LA4874-A
L9	Thorlabs	AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier	APE
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01
Motorized flipper	Thorlabs	MFF101/M
multifunctional acquisition card	National Instrument	PCIe-6363
Oscilloscope	Tektronix	TDS2012C
Photodiode	APE		For detecting SRS signal
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Polarizing beam splitter	Thorlabs	CCM1-PBS252/M
Power meter	Newport	843-R
Saline	Braun
Scan lens L5	Thorlabs	SL50-CLS2
Scanning mirror	Cambridge Technology	6215H
Silicone gel	World Precision Inc.	KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser	Coherent	Chameleon Ultra II
Tube lens L6	Thorlabs	TTL200-S8