誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。
誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、固有の分子振動に基づいて、その天然微小環境における生体組織の標識のないイメージングを可能にし、したがって、細胞内分解能での生物学的プロセスの in vivo 研究のための完璧なツールを提供する。2光子励起蛍光(TPEF)イメージングをSRS顕微鏡に統合することにより、組織のデュアルモーダル in vivo イメージングは、細胞代謝、免疫応答、組織リモデリングなどに関与する動的プロセスを理解するのに役立つ、複数の視点から重要な生化学的および生物物理学的情報を取得できます。このビデオプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡システムのセットアップと、動物の脊髄の in vivo イメージング方法が導入されています。脊髄は、中枢神経系の一部として、脳と末梢神経系との間のコミュニケーションにおいて重要な役割を果たしている。リン脂質が豊富なミエリン鞘は、軸索を囲んで絶縁し、活動電位の塩分化伝導を可能にする。脊髄内のミエリン鞘の インビボ イメージングは、神経変性疾患および脊髄損傷の進行を研究するために重要である。このプロトコルはまた、高解像度の生物学的画像を取得するための動物調製および インビボ TPEF-SRSイメージング法についても記載しています。
ラマン顕微鏡1,2は、生体分子中の様々な化学結合の特徴的な周波数に基づいて生体組織を画像化する強力な標識フリー法として浮上している。ラマン顕微鏡は、その非侵襲的で適応性の高いイメージング能力により、ミエリン鞘3,4,5、脂肪細胞6,7、および脂肪滴8,9,10などの生物学的組織における脂質富化成分のイメージングに広く使用されています。.誘導ラマンゲイン(SRG)または刺激ラマン損失(SRL)として取得された誘導ラマン散乱(SRS)信号はバックグラウンドフリーであり、自発的なラマン散乱と完全にスペクトル的に類似している11、12。さらに、SRLおよびSRGは分析物濃度に直線的に依存し、生化学成分の定量分析を可能にする9、11、13。二光子励起蛍光顕微鏡(TPEF)は、その固有の光学切片化能力、深い浸透深さ、および低い光毒性のために、in vivo生物学的イメージングに広く使用されてきました14,15,16。しかし、TPEFイメージングの性能は蛍光タグの特性に依存し、広帯域蛍光スペクトル8、17、18、19のために解決可能な色の数が制限されています。ラベルフリーSRSイメージングと蛍光ベースのTPEFイメージングは、2つの相補的なイメージングモダリティであり、それらの組み合わせは、組織の豊富な生物物理学的および生化学的情報を提供することができます。これら2つのイメージングモダリティは、どちらも非線形光学(NLO)プロセスに基づいており、1つの顕微鏡システムに簡単に統合できます。SRSイメージングとTPEFイメージングの組み合わせ、いわゆるデュアルモーダルイメージングは、細胞や組織の高次元イメージングとプロファイリングを可能にし、複雑な生物学的システムの包括的な理解を容易にします。具体的には、ピコ秒(ps)SRS顕微鏡は、フェムト秒(fs)SRS技術11と比較して高いスペクトル分解能で化学結合イメージングを達成することができ、生体組織、特に混雑した指紋領域20,21における複数の生化学的成分を区別することを可能にする。さらに、コヒーレントアンチストークス散乱(CARS)顕微鏡を統合した別の一般的に使用されるデュアルモーダルNLO顕微鏡システムと比較して、SRSはスペクトルおよび画像解釈、および検出感度の点でCARSよりも優れた性能を示しています11。SRS-TPEF顕微鏡は、カエノラブディティス・エレガンス9,22、アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシ脳5、マウス脳23,24、脊髄25,26、末梢神経27、脂肪組織7など、さまざまな生物系を研究するための強力なツールとして使用されてきました。
脊髄は脳とともに中枢神経系(CNS)を構成しています。生理学的および病理学的条件下でのCNSのインビボでの細胞活動を視覚化することは、CNS障害のメカニズムを理解し28,29,30および対応する治療法を開発するために重要である31,32,33。高速活動電位伝導のために軸索を包み込み、絶縁するミエリン鞘は、CNSの発達において重要な役割を果たしている。脱髄は、多発性硬化症などの白質障害の特徴として考えられています34。さらに、脊髄損傷後35、ミエリン破片はマクロファージの活性化を調節し、慢性炎症および二次損傷に寄与する36。したがって、生きたマウスモデルにおけるニューロンおよびグリア細胞と共にミエリン鞘のインビボイメージングは、CNS障害における動的プロセスを理解するのに非常に役立つ。
このプロトコルでは、自家製のTPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップ手順を説明し、マウス脊髄のデュアルモーダル in vivo イメージング方法を紹介します。
このプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップが詳細に説明されています。SRSイメージングの場合、ポンプビームとストークスビームはOPO内で時間的および空間的に重なり合っています。しかしながら、この重なりは、顕微鏡システムを通過した後に破壊され得る。したがって、ポンプビームとストークスビームの共局在化の空間的および時間的最適化の両方が、最適なSRSイメ?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、香港研究助成金評議会の助成金16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19、イノベーション技術委員会(ITCPD/17-9)、大学助成金委員会のエリア・オブ・エクセレンス・スキーム(AoE/M-604/16、AOE/M-09/12)、香港科技大学(HKUST)の助成金RPC10EG33を通じて支援を受けました。
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |