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Bioengineering

생체 내 결합 된 이광자 형광 및 자극 된 라만 산란 현미경을 사용한 생물학적 조직 이미징

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 특정 화학 결합의 고유 진동을 기반으로 생체 분자의 라벨 없는 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 통합 SRS 및 이광자 형광 현미경의 도구 셋업은 살아있는 마우스의 척수에서 세포 구조를 시각화하기 위해 기술된다.

Abstract

자극된 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 내재적 분자 진동을 기반으로 자연 미세환경에서 생물학적 조직을 라벨 없이 이미징할 수 있게 해줌으로써 세포 내 분해능에서 생물학적 과정에 대한 생체 내 연구를 위한 완벽한 도구를 제공합니다. 이광자 여기형광(TPEF) 이미징을 SRS 현미경에 통합함으로써 조직의 이중 모달 생체 내 이미징은 세포 대사, 면역 반응 및 조직 리모델링 등과 관련된 동적 과정을 이해하는 데 도움이 되는 다양한 관점에서 중요한 생화학 및 생물 물리학 정보를 획득할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 TPEF-SRS 현미경 시스템의 설정뿐만 아니라 동물 척수의 생체 내 이미징 방법이 도입됩니다. 척수는 중추 신경계의 일부로서 뇌와 말초 신경계 간의 의사 소통에 중요한 역할을합니다. 인지질이 풍부한 Myelin sheath는 축삭을 둘러싸고 절연하여 작용 잠재력의 염분 전도를 허용합니다. 척수에서 미엘린 외피의 생체 내 영상은 신경 퇴행성 질환 및 척수 손상의 진행을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 또한 고해상도 생물학적 이미지를 획득하기 위한 동물 준비 및 생체내 TPEF-SRS 이미징 방법을 기술한다.

Introduction

라만 현미경1,2는 생체 분자의 다양한 화학 결합의 특징적인 주파수를 기반으로 생물학적 조직을 이미지화하는 강력한 라벨 프리 방법으로 부상하고 있습니다. 비침습적이고 잘 적응하는 이미징 기능으로 인해 라만 현미경은 미엘린 외피3,4,5, 지방세포6,7 및 지질 방울8,9,10과 같은 생물학적 조직에서 지질 풍부 성분을 이미징하는 데 널리 사용되었습니다. . 자극된 라만 이득(SRG) 또는 자극된 라만 손실(SRL)로서 획득된 자극된 라만 산란(SRS) 신호는 배경이 없으며, 자발적인 라만 산란과 완벽한 스펙트럼 유사성을 나타낸다11,12. 또한, SRL 및 SRG는 분석물 농도에 선형적으로 의존하므로 생화학 성분9,11,13의 정량적 분석이 가능합니다. 이광자 여기된 형광 현미경(TPEF)은 고유의 광학 단면화 능력, 깊은 침투 깊이 및 낮은 광독성으로 인해 생체 내 생물학적 이미징에 널리 사용되어 왔습니다14,15,16. 그러나, TPEF 이미징의 성능은 형광 태그의 특성에 의존하며, 분해 가능한 색상의 수는 광대역 형광 스펙트럼8,17,18,19로 인해 제한된다. 라벨이 없는 SRS 이미징 및 형광 기반 TPEF 이미징은 두 가지 상보적인 이미징 방식이며, 이들의 조합은 조직의 풍부한 생물물리학적 및 생화학적 정보를 제공할 수 있다. 이 두 가지 이미징 방식은 모두 비선형 광학 (NLO) 프로세스를 기반으로하므로 하나의 현미경 시스템에서 간단하게 통합 할 수 있습니다. SRS와 TPEF 이미징, 소위 이중 모달 이미징의 조합은 세포와 조직의 고차원 이미징 및 프로파일 링을 가능하게하여 복잡한 생물학적 시스템에 대한 포괄적 인 이해를 용이하게합니다. 특히, 피코초(ps) SRS 현미경 검사는 펨토초(fs) SRS 기술11에 비해 높은 스펙트럼 분해능을 갖는 화학 결합 이미징을 달성할 수 있어, 생물학적 조직, 특히 혼잡한 지문 영역20,21에서 여러 생화학적 성분을 구별할 수 있다. 또한, 코히어런트 스토크스 산란(CARS) 현미경의 통합과 함께 일반적으로 사용되는 다른 이중 모달 NLO 현미경 시스템과 비교하여, SRS는 스펙트럼 및 이미지 해석 및 검출 감도 측면에서 CARS에 우수한 성능을 보여줍니다11. SRS-TPEF 현미경은 예쁜꼬마선 충9,22, 제노푸스 래비스 올챙이 뇌5, 마우스 뇌23,24, 척수25,26, 말초 신경27 및 지방 조직7 등과 같은 다양한 생물학적 시스템을 연구하는 강력한 도구로 사용되었습니다.

척수는 뇌와 함께 중추 신경계 (CNS)를 구성합니다. 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 생체내 CNS에서의 세포 활성을 시각화하는 것은 CNS 장애28,29,30의 메카니즘을 이해하고 상응하는 치료법을 개발하는 데 매우 중요하다31,32,33. 고속 작용 전위 전도를 위해 축삭돌기를 감싸고 절연하는 Myelin sheath는 CNS 개발에 중요한 역할을합니다. 탈수초화는 다발성 경화증과 같은 백질 장애의 특징으로 생각된다34. 또한, 척수 손상 후35, 미엘린 파편은 대식세포 활성화를 조절하여 만성 염증 및 이차 손상에 기여할 수 있습니다36. 따라서, 살아있는 마우스 모델에서 뉴런 및 신경교세포와 함께 미엘린 외피의 생체내 영상화는 CNS 장애에서 역동적인 과정을 이해하는 데 큰 도움이 된다.

이 프로토콜에서는 자체 제작된 TPEF-SRS 현미경의 기본 설정 절차가 설명되고 마우스 척수에 대한 이중 모달 생체 내 이미징 방법이 도입됩니다.

Protocol

이 작업에서 수행 된 모든 동물 절차는 홍콩 과학 기술 대학 (HKUST)의 실험실 동물 시설의 지침에 따라 수행되며 HKUST의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다. TPEF-SRS 현미경을 설정하고 작동하려면 레이저 취급을 위한 안전 교육이 필요합니다. 레이저를 다룰 때는 항상 적절한 파장 범위의 레이저 안전 고글을 착용하십시오. 1. TPEF-SRS 현미경 설치(설정 회로도는 <str…

Representative Results

미엘린 외피뿐만 아니라 척추 축색돌기의 생체내 이중 모달 영상은 등쪽 뿌리 신경절 구심성 뉴런에서 EYFP를 발현하는 Thy1-YFPH 형질전환 마우스를 사용하여 수행된다(도 3). 이 표지 된 구심성 뉴런은 말초 신경에서 척수로 감각 정보를 전달하며, 중앙 지점은 척수 등쪽 기둥에 위치합니다. TPEF-SRS 현미경을 사용하면 조밀하게 분포된 미엘린 시스를 라벨이 없는 SRS 이미…

Discussion

이 프로토콜에서, TPEF-SRS 현미경의 기본 셋업이 상세히 설명된다. SRS 이미징의 경우, 펌프와 스토크스 빔은 OPO 내부에서 시간적으로나 공간적으로 겹쳐집니다. 그러나, 이러한 중첩은 현미경 시스템을 통과한 후에 중단될 수 있다. 따라서 펌프와 스토크스 빔의 공동 현지화에 대한 공간적 및 시간적 최적화가 모두 최적의 SRS 이미징을 달성하는 데 필요하고 중요합니다. 펌프와 스토크스 빔 사이의…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 보조금 16103215, 16148816, 16102518, T13-607/12R 16102920, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, 혁신 및 기술위원회 (ITCPD/17-9), 대학 보조금위원회 우수 제도 영역 (AoE / M-604 / 16, AOE / M-09 / 12) 및 보조금 RPC10EG33을 통한 홍콩 과학 기술 대학 (HKUST)을 통해 홍콩 연구 보조금위원회에서 지원했습니다.

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
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References

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Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
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