JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

Abstract

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) maakt labelvrije beeldvorming van de biologische weefsels in zijn natuurlijke micro-omgeving mogelijk op basis van intrinsieke moleculaire trillingen, waardoor een perfect hulpmiddel wordt geboden voor in vivo studie van biologische processen met subcellulaire resolutie. Door twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beeldvorming in de SRS-microscoop te integreren, kan de dual-modale in vivo beeldvorming van weefsels kritische biochemische en biofysische informatie vanuit meerdere perspectieven verkrijgen die helpt bij het begrijpen van de dynamische processen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering, enz. In dit videoprotocol wordt de opstelling van een TPEF-SRS microscoopsysteem en de in vivo beeldvormingsmethode van het dierlijke ruggenmerg geïntroduceerd. Het ruggenmerg, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, speelt een cruciale rol in de communicatie tussen de hersenen en het perifere zenuwstelsel. Myelineschede, overvloedig aanwezig in fosfolipiden, omringt en isoleert het axon om zoute geleiding van actiepotentialen mogelijk te maken. In vivo beeldvorming van myelinescheden in het ruggenmerg is belangrijk om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen. Het protocol beschrijft ook dierbereiding en in vivo TPEF-SRS-beeldvormingsmethoden om biologische beelden met hoge resolutie te verkrijgen.

Introduction

Raman microscopie1,2 is in opkomst als een krachtige labelvrije methode om biologische weefsels in beeld te brengen op basis van de karakteristieke frequenties van verschillende chemische bindingen in biomoleculen. Vanwege het niet-invasieve en goed adaptieve beeldvormingsvermogen is Raman-microscopie op grote schaal gebruikt voor het afbeelden van lipide-verrijkte componenten in biologische weefsels zoals myelineschede3,4,5, adipocyten6,7 en lipidedruppels8,9,10 . Gestimuleerd Raman-verstrooiingssignaal (SRS) verkregen als gestimuleerde Raman-versterking (SRG) of gestimuleerd Raman-verlies (SRL) is achtergrondvrij en vertoont perfecte spectrale gelijkenis met spontane Raman-verstrooiing11,12. Bovendien zijn SRL en SRG lineair afhankelijk van de analytconcentratie, waardoor kwantitatieve analyse van biochemische componenten mogelijk is9,11,13. Twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (TPEF) is veel gebruikt voor in vivo biologische beeldvorming vanwege het inherente optische sectioningvermogen, de diepe penetratiediepte en de lage fototoxiciteit14,15,16. De prestaties van TPEF-beeldvorming zijn echter afhankelijk van de kenmerken van fluorescerende tags en het aantal oplosbare kleuren is beperkt vanwege de breedbandfluorescentiespectraspray8,17,18,19. Labelvrije SRS-beeldvorming en op fluorescentie gebaseerde TPEF-beeldvorming zijn twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten en hun combinatie kan overvloedige biofysische en biochemische informatie van weefsels bieden. Deze twee beeldvormingsmodaliteiten zijn beide gebaseerd op de niet-lineaire optische (NLO) processen, die eenvoudige integratie in één microscoopsysteem mogelijk maken. De combinatie van de SRS- en TPEF-beeldvorming, de zogenaamde dual-modale beeldvorming, maakt hoogdimensionale beeldvorming en profilering van cellen en weefsels mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van complexe biologische systemen wordt vergemakkelijkt. In het bijzonder kan picoseconde (ps) SRS-microscopie chemische bindingsbeeldvorming bereiken met een hoge spectrale resolutie in vergelijking met femtoseconde (fs) SRS-techniek11, waardoor meerdere biochemische componenten in biologisch weefsel kunnen worden onderscheiden, vooral in het overvolle vingerafdrukgebied20,21. Bovendien, in vergelijking met een ander veelgebruikt dual-modaal NLO-microscoopsysteem met integratie van coherente anti-Stokes-verstrooiingsmicroscoop (CARS), vertoont SRS superieure prestaties ten opzichte van CARS in termen van spectrale en beeldinterpretatie en detectiegevoeligheid11. De SRS-TPEF microscoop is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om verschillende biologische systemen te bestuderen, zoals Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kikkervis hersenen5, muizenbrein23,24, ruggenmerg25,26, perifere zenuw27 en vetweefsel7, enz.

Het ruggenmerg vormt samen met de hersenen het centrale zenuwstelsel (CZS). Het visualiseren van cellulaire activiteiten in het CZS in vivo onder fysiologische en pathologische omstandigheden is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van CZS-aandoeningen28,29,30 en voor het ontwikkelen van overeenkomstige therapieën31,32,33. Myelineschede, die axonen omwikkelt en isoleert voor snelle actiepotentiaalgeleiding, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van het CZS. Demyelinisatie wordt gezien als een kenmerk bij wittestofstoornissen, zoals multiple sclerose34. Bovendien kan myeline-puin na ruggenmergletsel35 de activering van macrofagen moduleren, wat bijdraagt aan chronische ontsteking en secundair letsel36. Daarom is in vivo beeldvorming van myelineschede samen met neuronen en gliacellen in levende muismodellen van grote hulp om de dynamische processen bij CZS-aandoeningen te begrijpen.

In dit protocol worden de fundamentele installatieprocedures van een zelfgebouwde TPEF-SRS-microscoop beschreven en worden de dual-modale in vivo beeldvormingsmethoden voor het ruggenmerg van muizen geïntroduceerd.

Protocol

Alle dierprocedures die in dit werk worden uitgevoerd, worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Laboratory Animal Facility van de Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) en zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van HKUST. Veiligheidstraining voor laserbehandeling is vereist om de TPEF-SRS-microscoop in te stellen en te bedienen. Draag altijd een laserveiligheidsbril met het juiste golflengtebereik bij het omgaan met laser. 1. Opstelling van de TPEF-SRS mi…

Representative Results

In vivo dual-modale beeldvorming van spinale axonen en myelinescheden wordt uitgevoerd met behulp van de Thy1-YFPH transgene muizen, die EYFP tot expressie brengen in dorsale wortel ganglion afferente neuronen (figuur 3). Deze gelabelde afferente neuronen geven de sensorische informatie van de perifere zenuw door aan het ruggenmerg, met de centrale tak in de dorsale kolom van het ruggenmerg. Met de TPEF-SRS-microscoop kan een dicht verdeelde myelineschede duidelijk worden gevisualis…

Discussion

In dit protocol wordt de basisopstelling van de TPEF-SRS microscoop in detail beschreven. Voor SRS-beeldvorming zijn de pomp- en Stokes-stralen tijdelijk en ruimtelijk overlapt in de OPO. Deze overlapping kan echter worden verstoord na het passeren van het microscoopsysteem. Daarom is zowel ruimtelijke als temporele optimalisatie van de colocalisatie van de pomp en Stokes-balken noodzakelijk en cruciaal voor het bereiken van optimale SRS-beeldvorming. De temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-bundel is gerelat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Hong Kong Research Grants Council door middel van subsidies 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, de Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), het Area of Excellence Scheme van de University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) en de Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) door middel van subsidie RPC10EG33.

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

In Vivo ImagingTwo-photon FluorescenceStimulated Raman ScatteringMicroscopySubcellular ResolutionChemical SpecificityCellular MetabolismImmune ResponseNeurodegenerative DiseasesSpinal Cord InjuryTitanium Sapphire LaserOPOPhotodetectorOscilloscopeEOMPump LaserWavelengthOptical Alignment
check_url/63411?article_type=t&slug=in-vivo-imaging-biological-tissues-with-combined-two-photon

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image