Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.
Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) maakt labelvrije beeldvorming van de biologische weefsels in zijn natuurlijke micro-omgeving mogelijk op basis van intrinsieke moleculaire trillingen, waardoor een perfect hulpmiddel wordt geboden voor in vivo studie van biologische processen met subcellulaire resolutie. Door twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beeldvorming in de SRS-microscoop te integreren, kan de dual-modale in vivo beeldvorming van weefsels kritische biochemische en biofysische informatie vanuit meerdere perspectieven verkrijgen die helpt bij het begrijpen van de dynamische processen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering, enz. In dit videoprotocol wordt de opstelling van een TPEF-SRS microscoopsysteem en de in vivo beeldvormingsmethode van het dierlijke ruggenmerg geïntroduceerd. Het ruggenmerg, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, speelt een cruciale rol in de communicatie tussen de hersenen en het perifere zenuwstelsel. Myelineschede, overvloedig aanwezig in fosfolipiden, omringt en isoleert het axon om zoute geleiding van actiepotentialen mogelijk te maken. In vivo beeldvorming van myelinescheden in het ruggenmerg is belangrijk om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen. Het protocol beschrijft ook dierbereiding en in vivo TPEF-SRS-beeldvormingsmethoden om biologische beelden met hoge resolutie te verkrijgen.
Raman microscopie1,2 is in opkomst als een krachtige labelvrije methode om biologische weefsels in beeld te brengen op basis van de karakteristieke frequenties van verschillende chemische bindingen in biomoleculen. Vanwege het niet-invasieve en goed adaptieve beeldvormingsvermogen is Raman-microscopie op grote schaal gebruikt voor het afbeelden van lipide-verrijkte componenten in biologische weefsels zoals myelineschede3,4,5, adipocyten6,7 en lipidedruppels8,9,10 . Gestimuleerd Raman-verstrooiingssignaal (SRS) verkregen als gestimuleerde Raman-versterking (SRG) of gestimuleerd Raman-verlies (SRL) is achtergrondvrij en vertoont perfecte spectrale gelijkenis met spontane Raman-verstrooiing11,12. Bovendien zijn SRL en SRG lineair afhankelijk van de analytconcentratie, waardoor kwantitatieve analyse van biochemische componenten mogelijk is9,11,13. Twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (TPEF) is veel gebruikt voor in vivo biologische beeldvorming vanwege het inherente optische sectioningvermogen, de diepe penetratiediepte en de lage fototoxiciteit14,15,16. De prestaties van TPEF-beeldvorming zijn echter afhankelijk van de kenmerken van fluorescerende tags en het aantal oplosbare kleuren is beperkt vanwege de breedbandfluorescentiespectraspray8,17,18,19. Labelvrije SRS-beeldvorming en op fluorescentie gebaseerde TPEF-beeldvorming zijn twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten en hun combinatie kan overvloedige biofysische en biochemische informatie van weefsels bieden. Deze twee beeldvormingsmodaliteiten zijn beide gebaseerd op de niet-lineaire optische (NLO) processen, die eenvoudige integratie in één microscoopsysteem mogelijk maken. De combinatie van de SRS- en TPEF-beeldvorming, de zogenaamde dual-modale beeldvorming, maakt hoogdimensionale beeldvorming en profilering van cellen en weefsels mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van complexe biologische systemen wordt vergemakkelijkt. In het bijzonder kan picoseconde (ps) SRS-microscopie chemische bindingsbeeldvorming bereiken met een hoge spectrale resolutie in vergelijking met femtoseconde (fs) SRS-techniek11, waardoor meerdere biochemische componenten in biologisch weefsel kunnen worden onderscheiden, vooral in het overvolle vingerafdrukgebied20,21. Bovendien, in vergelijking met een ander veelgebruikt dual-modaal NLO-microscoopsysteem met integratie van coherente anti-Stokes-verstrooiingsmicroscoop (CARS), vertoont SRS superieure prestaties ten opzichte van CARS in termen van spectrale en beeldinterpretatie en detectiegevoeligheid11. De SRS-TPEF microscoop is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om verschillende biologische systemen te bestuderen, zoals Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kikkervis hersenen5, muizenbrein23,24, ruggenmerg25,26, perifere zenuw27 en vetweefsel7, enz.
Het ruggenmerg vormt samen met de hersenen het centrale zenuwstelsel (CZS). Het visualiseren van cellulaire activiteiten in het CZS in vivo onder fysiologische en pathologische omstandigheden is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van CZS-aandoeningen28,29,30 en voor het ontwikkelen van overeenkomstige therapieën31,32,33. Myelineschede, die axonen omwikkelt en isoleert voor snelle actiepotentiaalgeleiding, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van het CZS. Demyelinisatie wordt gezien als een kenmerk bij wittestofstoornissen, zoals multiple sclerose34. Bovendien kan myeline-puin na ruggenmergletsel35 de activering van macrofagen moduleren, wat bijdraagt aan chronische ontsteking en secundair letsel36. Daarom is in vivo beeldvorming van myelineschede samen met neuronen en gliacellen in levende muismodellen van grote hulp om de dynamische processen bij CZS-aandoeningen te begrijpen.
In dit protocol worden de fundamentele installatieprocedures van een zelfgebouwde TPEF-SRS-microscoop beschreven en worden de dual-modale in vivo beeldvormingsmethoden voor het ruggenmerg van muizen geïntroduceerd.
In dit protocol wordt de basisopstelling van de TPEF-SRS microscoop in detail beschreven. Voor SRS-beeldvorming zijn de pomp- en Stokes-stralen tijdelijk en ruimtelijk overlapt in de OPO. Deze overlapping kan echter worden verstoord na het passeren van het microscoopsysteem. Daarom is zowel ruimtelijke als temporele optimalisatie van de colocalisatie van de pomp en Stokes-balken noodzakelijk en cruciaal voor het bereiken van optimale SRS-beeldvorming. De temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-bundel is gerelat…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Hong Kong Research Grants Council door middel van subsidies 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, de Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), het Area of Excellence Scheme van de University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) en de Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) door middel van subsidie RPC10EG33.
#2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
Burn cream | Betadine | ||
Camera | Sony | α6300 | |
Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
Depilating cream | Veet | ||
FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
Iodine | Betadine | ||
IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
Iris | Thorlabs | CPA1 | |
L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
L7 | f=100 mm, AB coating | ||
L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
Lock-in amplifier | APE | ||
Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
Power meter | Newport | 843-R | |
Saline | Braun | ||
Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |