JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

In vivo Avbildning av biologiska vävnader med kombinerad tvåfoto fluorescens och stimulerad Raman spridningsmikroskopi

Published: December 20, 2021
doi:
10.3791/63411
, , ,
1Department of Electronic and Computer Engineering,The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience,The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health,The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center,The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology

Summary

Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av biomolekyler baserat på deras inneboende vibrationer av specifika kemiska bindningar. I detta protokoll beskrivs den instrumentella installationen av en integrerad SRS och två-foton fluorescensmikroskop för att visualisera cellulära strukturer i ryggmärgen hos levande möss.

Abstract

Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi möjliggör etikettfri avbildning av de biologiska vävnaderna i dess naturliga mikromiljö baserad på inneboende molekylär vibration, vilket ger ett perfekt verktyg för in vivo-studier av biologiska processer vid subcellulär upplösning. Genom att integrera TPEF-avbildning (Two-photon excited fluorescence) i SRS-mikroskopet kan dubbelmodal in vivo-avbildning av vävnader förvärva kritisk biokemisk och biofysisk information från flera perspektiv som hjälper till att förstå de dynamiska processerna som är involverade i cellulär metabolism, immunsvar och vävnadsrenovering etc. I detta videoprotokoll introduceras installationen av ett TPEF-SRS-mikroskopsystem samt in vivo-avbildningsmetoden för djurets ryggmärg. Ryggmärgen, som en del av centrala nervsystemet, spelar en avgörande roll i kommunikationen mellan hjärnan och det perifera nervsystemet. Myelin mantel, riklig i fosfolipider, omger och isolerar axon för att tillåta salt ledning av handlingspotentialer. In vivo imaging av myelmantlar i ryggmärgen är viktigt för att studera utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar och ryggmärgsskada. Protokollet beskriver också djurpreparat och in vivo TPEF-SRS-avbildningsmetoder för att förvärva högupplösta biologiska bilder.

Introduction

Raman mikroskopi1,2 växer fram som en kraftfull etikettfri metod för att avbilda biologiska vävnader baserat på de karakteristiska frekvenserna av olika kemiska bindningar i biomolekyler. På grund av sin icke-invasiva och välanpassade avbildningsförmåga har Raman-mikroskopi använts i stor utsträckning för att avbilda lipidberikade komponenter i biologiska vävnader som myelslida3,4,5, adipocyter6,7 och lipiddroppar8,9,10 . Stimulerad Raman spridning (SRS) signal förvärvas som stimulerad Raman vinst (SRG) eller stimulerad Raman förlust (SRL) är bakgrundsfri, visar perfekt spektral likhet med spontan Raman spridning11,12. Dessutom är SRL och SRG linjärt beroende av analytkoncentrationen, vilket möjliggör kvantitativ analys av biokemiska komponenter9,11,13. Två-foton upphetsad fluorescensmikroskopi (TPEF) har använts i stor utsträckning för in vivo biologisk avbildning på grund av dess inneboende optiska sektionsförmåga, djupa penetrationsdjup och låg fototoxicitet14,15,16. Prestandan hos TPEF-avbildning beror dock på egenskaperna hos fluorescerande taggar, och antalet lösta färger är begränsat på grund av bredbandsfluorescensspektra8,17,18,19. Label-free SRS imaging och fluorescence-baserade TPEF imaging är två kompletterande bildframställning modaliteter, och deras kombination kan ge riklig biofysisk och biokemisk information om vävnader. Dessa två bildframställningsmetoder är båda baserade på de icke-linjära optiska (NLO) processerna, vilket möjliggör enkel integration i ett mikroskopsystem. Kombinationen av SRS- och TPEF-avbildning, den så kallade dubbelmodala avbildningen, möjliggör högdimensionell avbildning och profilering av celler och vävnader, vilket underlättar en omfattande förståelse av komplexa biologiska system. Specifikt kan picosekund (ps) SRS-mikroskopi uppnå kemisk bondavbildning med hög spektralupplösning jämfört med femtosekund (fs) SRS-teknik11, vilket gör det möjligt att skilja flera biokemiska komponenter i biologisk vävnad, särskilt i den trånga fingeravtrycksregionen20,21. Jämfört med ett annat vanligt dubbelmodalt NLO-mikroskopsystem med integrering av sammanhängande anti-Stokes-spridningsmikroskop (CARS), visar SRS dessutom överlägsen prestanda för CARS när det gäller spektral- och bildtolkning samt detekteringskänslighet11. SRS-TPEF mikroskopet har använts som ett kraftfullt verktyg för att studera olika biologiska system, såsom Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, mushjärna23,24, ryggmärg25,26, perifer nerv27 och fettvävnad7, etc.

Ryggmärgen tillsammans med hjärnan utgör centrala nervsystemet (CNS). Visualisering av cellulära aktiviteter i CNS in vivo under fysiologiska och patologiska förhållanden är avgörande för att förstå mekanismerna för CNS störningar28,29,30 och för att utveckla motsvarande terapier31,32,33. Myelin-mantel, som lindar in och isolerar axoner för höghastighetsverkanspotentialledning, spelar en viktig roll i utvecklingen av CNS. Demyelination anses vara ett kännetecken i vit fråga störningar, såsom multipel skleros34. Dessutom, efter ryggmärgsskada35, myelin skräp kan modulera makrofag aktivering, bidra till kronisk inflammation och sekundär skada36. Därför är in vivo imaging av myelisk mantel tillsammans med nervceller och gliaceller i levande musmodeller till stor hjälp för att förstå de dynamiska processerna i CNS störningar.

I detta protokoll beskrivs de grundläggande installationsförfarandena för ett hembyggt TPEF-SRS-mikroskop och de dubbla modala in vivo-avbildningsmetoderna för mus ryggmärg introduceras.

Protocol

Alla djurförsök som utförs i detta arbete utförs i enlighet med riktlinjerna från Laboratory Animal Facility vid Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) och har godkänts av HKUST:s djuriska kommitté. Säkerhetsutbildning för laserhantering krävs för att installera och driva TPEF-SRS-mikroskopet. Använd alltid laserglasögon med lämplig våglängdsintervall när du hanterar laser. 1. Installation av TPEF-SRS-mikroskopet (för installationsschema se <str…

Representative Results

In vivo dual-modal imaging av spinal axons samt myelin mantlar utförs med hjälp av Thy1-YFPH transgena möss, som uttrycker EYFP i dorsala rot ganglion afferent nervceller (figur 3). Dessa märkta afferenta nervceller vidarebefordrar den sensoriska informationen från perifera nerv till ryggmärgen, med den centrala grenen ligger i ryggmärgen dorsala kolonnen. Med TPEF-SRS mikroskopet kan tätt fördelade myelhylsa tydligt visualiseras med hjälp av etikettfri SRS-avbildning, och…

Discussion

I det här protokollet beskrivs den grundläggande inställningen av TPEF-SRS-mikroskopet i detalj. För SRS-avbildning överlappas pump- och Stokesstrålarna tidsmässigt och rumsligt inuti OPO. Denna överlappning kan dock störas efter att ha passerat genom mikroskopsystemet. Därför är både rumslig och tidsmässig optimering av colocalization av pumpen och Stokes strålar nödvändigt och avgörande för att uppnå optimal SRS-avbildning. Den tidsmässiga fördröjningen mellan pumpen och Stokes-strålen är rela…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Hong Kong Research Grants Council genom bidrag 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), området för excellensprogram för university grants committee (AoE/M-604/16, AOE/M-16)

Materials

#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25×36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. . Raman Microscopy: Developments and Applications. , (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -. X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer’s disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -. F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. . Introduction to Optics. , (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -. X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -. J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).

Tags

In Vivo ImagingTwo-photon FluorescenceStimulated Raman ScatteringMicroscopySubcellular ResolutionChemical SpecificityCellular MetabolismImmune ResponseNeurodegenerative DiseasesSpinal Cord InjuryTitanium Sapphire LaserOPOPhotodetectorOscilloscopeEOMPump LaserWavelengthOptical Alignment
check_url/63411?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image