Isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het screenen van bodembiodiversiteit om te zoeken naar schimmelstammen die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen. Ten eerste worden schimmelstammen die kunnen groeien op humuszuren of lignocellulose geïsoleerd. Hun activiteit wordt vervolgens getest, zowel in enzymatische assays als op verontreinigende stoffen zoals koolwaterstoffen en kunststoffen.
Abstract
Milieuvervuiling is een toenemend probleem en het identificeren van schimmels die betrokken zijn bij het bioremediatieproces is een essentiële taak. De bodem herbergt een ongelooflijke diversiteit aan microbieel leven en kan een goede bron zijn van deze bioremediatieve schimmels. Dit werk heeft tot doel bodemschimmels met bioremediatiepotentieel te zoeken door gebruik te maken van verschillende screeningstests. Minerale cultuurmedia aangevuld met recalcitrante stoffen als enige koolstofbron werden gebruikt als groeitests. Eerst werden bodemverdunningen op petrischalen verguld met mineraal medium gewijzigd met humuszuren of lignocellulose. De groeiende schimmelkolonies werden geïsoleerd en getest op verschillende substraten, zoals complexe mengsels van koolwaterstoffen (vaseline en gebruikte motorolie) en poeders van verschillende plastic polymeren (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kwalitatieve enzymatische tests werden geassocieerd met de groeitests om de productie van esterasen, laccases, peroxidasen en proteasen te onderzoeken. Deze enzymen zijn betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrant materiaal en hun constitutieve secretie door de onderzochte schimmelstammen zou het potentieel kunnen hebben om te worden benut voor bioremediatie. Meer dan 100 stammen werden geïsoleerd en getest, en verschillende isolaten met een goed bioremediatiepotentieel werden gevonden. Kortom, de beschreven screeningstests zijn een eenvoudige en goedkope methode om schimmelstammen met bioremediatiepotentieel uit de bodem te identificeren. Bovendien is het mogelijk om de screeningstests voor verschillende verontreinigende stoffen aan te passen aan de vereisten, door andere recalcitrante stoffen toe te voegen aan minimale kweekmedia.
Introduction
De bodem is een fundamenteel onderdeel van het leven op aarde en is de basis van vele ecosystemen. De mineralen, organische stof en micro-organismen in de bodem kunnen als één systeem worden beschouwd, met nauwe associaties en interacties tussen hen. De interacties van deze verbindingen hebben een belangrijke invloed op terrestrische processen, milieukwaliteit en de gezondheid van ecosystemen1. Bodemverontreiniging levert wereldwijd ernstige milieuproblemen op. De willekeurige, langdurige en overmatige toepassing van recalcitrante en giftige stoffen, zoals pesticiden, aardolieproducten, kunststoffen en andere chemicaliën, heeft ernstige gevolgen voor de bodemecologie en kan als gevolg daarvan de bodemmicrobiota veranderen. Microbiële gemeenschappen in de bodem bestaan uit een breed scala aan organismen in verschillende fysiologische toestanden, waarvan de meerderheid bacteriën en schimmels zijn. Veel van de verontreinigingen in de bodem hebben stabiliteit op middellange tot lange termijn en hun persistentie kan leiden tot de ontwikkeling van adaptieve mechanismen waarmee de micro-organismen recalcitrante stoffen als voedingsstoffen kunnen gebruiken 2,3. Deze micro-organismen kunnen daarom in aanmerking komen voor bioremediatietechnieken.
Bioremediatie probeert de effecten van vervuiling te verminderen door micro-organismen en hun enzymen te gebruiken voor de afbraak of omzetting van afval in minder toxische of niet-toxische verbindingen. Verschillende soorten archaea, bacteriën, algen en schimmels bezitten dit bioremediatievermogen4. Als gevolg van hun specifieke biologisch afbreekbare acties zijn schimmels vooral veelbelovende organismen voor bioremediatie. Ze kunnen verschillende substraten aanvallen met behulp van hun hyphal-netwerk, waardoor ze efficiënter de bodemmatrix kunnen binnendringen dan andere micro-organismen. Bovendien kunnen ze ontoegankelijke interstices bereiken waar verontreinigingen moeilijk te verwijderen zijn5, en ze kunnen ook lage vochtniveausoverleven 6. Bovendien synthetiseren schimmels verschillende cassettes van niet-specifieke enzymen, meestal om natuurlijke recalcitrante stoffen zoals cellulose, lignine en humuszuren af te breken. Degenen die het doelsubstraat missen, kunnen betrokken zijn bij de afbraak van een breed scala aan recalcitrante verontreinigende stoffen, zoals koolwaterstoffen, kunststoffen en pesticiden 7,8,9,10. Daarom, hoewel veel schimmelsoorten al zijn gemeld als bioremediatiemiddelen, is er een toenemende interesse in het verkennen van soorten die nog niet zijn bestudeerd om kandidaten te selecteren voor de bioremediatie van recalcitrante verontreinigende stoffen. De soorten waarvan al bekend is dat ze bioremediatie-eigenschappen hebben, behoren tot de phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 en Mucoromycota. Van de geslachten Penicillium en Aspergillus is bijvoorbeeld bekend dat ze betrokken zijn bij de afbraak van alifatische koolwaterstoffen13, verschillende plastic polymeren 16,17,18, zware metalen 19 en kleurstoffen20. Evenzo hebben studies uitgevoerd op basidiomycetenschimmels, zoals Phanerochaete chrysosporium en Trametes versicolor, hun betrokkenheid bij de oxidatie van recalcitrante materialen zoals aromatische koolwaterstoffen13 en kunststoffen21 aangetoond. Een ander voorbeeld van schimmels die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen zijn de zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. en Cunninghamella spp.22,23. In het bijzonder is Cunninghamella in staat om aromatische koolwaterstoffen te oxideren en wordt het beschouwd als een modelorganisme voor het bestuderen van de ontgifting van producten uit een breed scala aan xenobiotica13.
Er zijn verschillende schimmelenzymen betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrante materialen 24,25, zoals esterase, laccase, peroxidase en protease. Laccases zijn koperhoudende oxidaties die in de cel worden geproduceerd en vervolgens worden uitgescheiden, die de oxidatie van een verscheidenheid aan fenolische en aromatische verbindingen mogelijk maken. Ze kunnen ortho- en paradifenolen, de aminogroepbevattende fenolen, lignine en de arylgroepbevattende diaminesafbreken 26. Peroxidasen gebruiken waterstofperoxide als mediator om lignine en andere aromatische verbindingen af te breken. Er zijn veel verschillende peroxidasen, maar degenen met het grootste potentieel om giftige stoffen af te breken zijn lignineperoxidase en mangaanperoxidase27.
Esterasen en proteasen behoren tot de groep van extra- of ectocellulaire enzymen, die buiten hun cellen van oorsprong werken, maar er nog steeds aan gebonden zijn. Deze enzymen kunnen de hydrolyse van grote recalcitrante moleculen katalyseren tot kleinere. Vanwege hun lage substraatspecificiteit kunnen deze enzymen een sleutelrol spelen bij de bioremediatie van verschillende verontreinigende stoffen, zoals textielkleurstoffen, effluenten die vrijkomen uit de pulp- en papierindustrie en leerlooien, aardolieproducten, kunststoffen en pesticiden 28,29,30.
Een aantal screeningsmethoden om te selecteren op bioremediatieve schimmelstammen zijn al gepubliceerd. Agarmedium op basis van stro is bijvoorbeeld gebruikt om te screenen op witrotschimmels met een hoog potentieel in de afbraak van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK’s)31; en kleine stukjes rottend hout zijn op moutextract agar (MEA) geplaatst om houtrotschimmels te isoleren32. De meeste methoden die al zijn voorgesteld, selecteren echter zeer specifieke schimmels op hun activiteit van belang. Dit onderzoek stelt een bredere aanpak voor voor het selecteren van bodemschimmels met een breder scala aan acties. De methode is gebaseerd op de initiële plating van seriële verdunningen van bodemmonsters op een medium dat is gewijzigd met humuszuren of lignocellulose gemengd met antibiotica om schimmels te selecteren met het vermogen om deze natuurlijke recalcitrante stoffen af te breken. Humuszuren en lignocellulose zijn in feite stoffen die extreem resistent zijn tegen biologische afbraak, omdat ze zeer complexe moleculaire structuren hebben, en dit stelt hen in staat om uitstekende indicatoren te zijn van het afbreekbare vermogen van de geteste schimmels33,34. Vervolgens worden de schimmels die in de eerste tests zijn geselecteerd, gescreend om die te identificeren met het potentieel om specifieke verontreinigende stoffen zoals vaseline, gebruikte motorolie en kunststoffen af te breken. Ten slotte worden kwalitatieve enzymatische tests uitgevoerd om schimmelstammen te detecteren die enzymen kunnen produceren die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen van recalcitrante stoffen. Voor dit doel worden protease- en esterasetests uitgevoerd, terwijl galluszuur en guaiacol worden gebruikt als indicatoren voor laccase- en andere ligninolytische enzymproductie35,36. Deze substraten worden gebruikt omdat er een sterke correlatie is gevonden tussen het vermogen van schimmels om ze te oxideren tot hun bruingekleurde vorm en het bezit van ligninolytisch vermogen 37,38,39.
Door deze protocollen is het mogelijk om schimmelstammen met een hoog degraderend potentieel en een breed werkingsspectrum rechtstreeks uit bodemmonsters te isoleren. De isolatie van deze schimmelstammen kan helpen bij het vinden van nieuwe kandidaten voor bioremediatiedoeleinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De rijke biodiversiteit van de bodem is een overvloedige bron van schimmels die tal van metabolische vermogens bezitten, waarvan sommige potentiële kandidaten voor bioremediatie kunnen zijn. Selectieve mediatests (sectie 1 van het protocol) zijn eenvoudig uit te voeren en effectieve methoden voor het isoleren van schimmels die kunnen groeien op natuurlijke complexe polymeren als hun enige koolstofbron. Schimmels kunnen extracellulaire, niet-specifieke hydrolasen en oxidoreductasen30 produceren, z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) van de Universiteit van Pavia en professor Solveig Tosi voor het bieden van de mogelijkheid voor dit werk.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
