석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이에 대한 토양 생물 다양성으로부터의 분리 및 스크리닝
Summary
여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.
Abstract
환경 오염은 증가하는 문제이며, 생물 정화 과정에 관여하는 곰팡이를 확인하는 것은 필수적인 작업입니다. 토양은 미생물 생물의 놀라운 다양성을 보유하고 있으며 이러한 생물 정화 균류의 좋은 원천이 될 수 있습니다. 이 연구는 다른 선별 검사를 사용하여 생물 개선 잠재력을 가진 토양 균류를 찾는 것을 목표로합니다. 유일한 탄소원으로서 석회화 물질을 보충한 미네랄 배양 배지를 성장 시험으로 사용하였다. 첫째, 토양 희석액을 휴믹산 또는 리그노셀룰로스로 개질된 미네랄 배지로 페트리 접시에 도금하였다. 성장하는 곰팡이 콜로니를 분리하고 탄화수소 (페트롤라툼 및 사용 된 모터 오일)의 복잡한 혼합물과 다른 플라스틱 폴리머 (PET, PP, PS, PUR, PVC)의 분말과 같은 다른 기질에서 테스트했습니다. 정성적 효소 시험은 에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제의 생산을 조사하기 위한 성장 시험과 관련되었다. 이 효소는 석회화 물질의 주요 분해 과정에 관여하며, 검사 된 곰팡이 균주에 의한 구성 분비는 생물 교정을 위해 악용 될 잠재력을 가질 수 있습니다. 100 개 이상의 균주를 분리하고 테스트했으며, 좋은 생물 개선 잠재력을 가진 몇 가지 분리 물이 발견되었습니다. 결론적으로, 설명 된 선별 시험은 토양에서 생물 정화 잠재력을 가진 곰팡이 균주를 확인하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 또한, 최소한의 배양 배지에 다른 재생 물질을 추가함으로써 요구 사항에 따라 다른 오염 물질에 대한 선별 테스트를 조정할 수 있습니다.
Introduction
토양은 지구상의 삶의 기본 구성 요소이며 많은 생태계의 기초입니다. 토양의 미네랄, 유기물 및 미생물은 하나의 시스템으로 간주 될 수 있으며 밀접한 연관성과 상호 작용이 발생합니다. 이러한 화합물의 상호 작용은 육상 과정, 환경 품질 및 생태계 건강에 중요한 영향을 미칩니다1. 토양 오염은 전 세계적으로 심각한 환경 문제를 제기합니다. 살충제, 석유 제품, 플라스틱 및 기타 화학 물질과 같은 석회화 물질 및 독성 물질의 무차별적이고 장기적이며 과도한 적용은 토양 생태학에 심각한 영향을 미치며 결과적으로 토양 미생물을 변화시킬 수 있습니다. 토양의 미생물 공동체는 다른 생리 학적 상태의 광범위한 유기체로 구성되어 있으며 대부분은 박테리아와 곰팡이입니다. 토양의 많은 오염 물질은 중장기 안정성을 가지고 있으며, 그 지속성은 미생물이 재생 물질을 영양소로 활용할 수있게 해주는 적응 메커니즘의 개발로 이어질 수 있습니다 2,3. 따라서 이러한 미생물은 생물 치료 기술로 간주 될 수 있습니다.
생물 정화는 폐기물을 덜 독성 또는 무독성 화합물로 분해 또는 변형시키기 위해 미생물과 그 효소를 사용하여 오염의 영향을 완화하려고 시도합니다. 고세균, 박테리아, 조류 및 곰팡이의 다양한 종은이 생물 치료 능력을 가지고 있습니다4. 그들의 특별한 생분해 작용의 결과로, 곰팡이는 특히 생물 개선을위한 유망한 유기체입니다. 그들은 히팔 네트워크를 사용하여 다른 기질을 공격 할 수있어 다른 미생물보다 토양 매트릭스에 더 효율적으로 침투 할 수 있습니다. 또한, 오염 물질을 제거하기 어려운 접근 할 수없는 간극에 도달 할 수 있습니다5, 그리고 그들은 또한 낮은 수분 수준6에서 살아남을 수 있습니다. 또한, 곰팡이는 비특이적 효소의 다른 카세트를 합성하여 일반적으로 셀룰로오스, 리그닌 및 휴믹산과 같은 천연 석회화 물질을 분해합니다. 표적 기질이 결여된 것들은 탄화수소, 플라스틱 및 살충제 7,8,9,10과 같은 광범위한 재석회성 오염 물질의 분해에 관여할 수 있다. 따라서 많은 곰팡이 종들이 이미 생물 정화제로보고되었지만 석회화 오염 물질의 생물 정화 후보를 선택하기 위해 아직 연구되지 않은 종을 탐구하는 데 관심이 높아지고 있습니다. 생물 치료 특성을 갖는 것으로 이미 알려진 종은 phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 및 Mucoromycota에 속합니다. 예를 들어, 페니실륨 속 및 아스퍼질러스는 지방족 탄화수소 13, 상이한 플라스틱 중합체16,17,18, 중금속 19, 및 염료20의 분해에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다. 마찬가지로, Phanerochaete chrysosporium 및 Trametes versicolor와 같은 basidiomycetes 진균에 대해 수행 된 연구는 방향족 탄화수소13 및 플라스틱21과 같은 석회화 물질의 산화에 관여하는 것으로 나타났습니다. 생분해 과정에 관여하는 진균의 또 다른 예는 zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., 및 Cunninghamella spp.22,23이다. 특히, 커닝하멜라는 방향족 탄화수소를 산화시킬 수 있으며, 광범위한 이종 바이오틱스13에서 제품의 해독을 연구하기위한 모델 유기체로 간주됩니다.
에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제와 같은 재석회화 물질(24,25)의 주요 분해 과정에 관여하는 몇몇 진균 효소가 있다. 락카제는 세포에서 생성되고 이어서 분비되는 구리 함유 산화제로서, 다양한 페놀성 및 방향족 화합물의 산화를 허용한다. 이들은 오르토 및 파라디페놀, 아미노기 함유 페놀, 리그닌, 및 아릴기 함유 디아민26을 분해할 수 있다. Peroxidases는 과산화수소를 매개체로 사용하여 리그닌 및 기타 방향족 화합물을 분해합니다. 많은 다른 퍼옥시다제가 있지만, 독성 물질을 분해할 가능성이 가장 큰 것은 리그닌 퍼옥시다제와 망간 퍼옥시다제27이다.
에스테라제 및 프로테아제는 세포 외 또는 외부 세포 효소의 그룹에 속하며, 이는 기원의 세포 외부에서 작용하지만 여전히 그들에 묶여 있습니다. 이 효소는 큰 반석회 분자를 더 작은 분자로 가수분해하는 촉매 작용을 할 수 있습니다. 기질 특이성이 낮기 때문에 이러한 효소는 섬유 염료, 펄프 및 제지 산업에서 방출되는 유출물 및 가죽 태닝, 석유 제품, 플라스틱 및 살충제28,29,30과 같은 다양한 오염 물질의 생물 정화에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
생물매개성 진균 균주를 선택하기 위한 다수의 스크리닝 방법이 이미 발표되었다. 예를 들어, 짚계 한천 배지는 다환식 방향족 탄화수소(PAH) 분해에서 높은 전위를 갖는 백색부후균을 스크리닝하기 위해 사용되어 왔다(31); 썩어가는 나무의 작은 조각이 맥아 추출물 한천 (MEA) 위에 놓여져 나무 썩은 곰팡이(32)를 분리했습니다. 그러나 이미 제안 된 대부분의 방법은 관심있는 활성에 대해 매우 구체적인 곰팡이를 선택합니다. 이 연구는 더 넓은 범위의 행동으로 토양 균류를 선택하기위한 더 넓은 접근법을 제안합니다. 이 방법은 항생제와 혼합 된 휴믹산 또는 리그노 셀룰로오스로 수정 된 배지에 토양 샘플의 연속 희석을 초기 도금하여 이러한 천연 석회화 물질을 분해하는 능력을 가진 곰팡이를 선택합니다. 휴믹산과 리그노셀룰로오스는 사실 매우 복잡한 분자 구조를 가지고 있기 때문에 생분해에 매우 저항력이 강한 물질이며, 이를 통해 시험된 진균33,34의 분해 능력에 대한 우수한 지표가 될 수 있습니다. 그 후, 첫 번째 테스트에서 선택된 곰팡이는 바셀린, 중고 엔진 오일 및 플라스틱과 같은 특정 오염 물질을 분해 할 가능성이있는 사람들을 식별하기 위해 선별됩니다. 마지막으로, 재생 물질의 생분해 과정에 관여하는 효소를 생산할 수있는 곰팡이 균주를 검출하기 위해 정성적 효소 테스트가 수행됩니다. 이를 위해 프로테아제 및 에스테라제 테스트가 수행되고 갈산과 구아아콜은 락카제 및 기타 리그놀로지분해 효소 생산35,36의 지표로 사용됩니다. 이들 기질은 진균이 갈색의 형태로 산화시키는 능력과 리그노분해 능력37,38,39의 보유 사이에 강한 상관관계가 발견되었기 때문에 사용된다.
이러한 프로토콜을 통해 높은 분해 잠재력과 광범위한 작용 스펙트럼을 가진 곰팡이 균주를 토양 샘플에서 직접 분리 할 수 있습니다. 이러한 곰팡이 균주의 분리는 생물 치료 목적을위한 새로운 후보자를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
토양의 풍부한 생물 다양성은 수많은 대사 능력을 가진 곰팡이의 풍부한 원천이며, 그 중 일부는 생물 개선을위한 잠재적 인 후보자가 될 수 있습니다. 선택적 배지 테스트 (프로토콜의 섹션 1)는 천연 복합 폴리머에서 성장할 수있는 곰팡이를 유일한 탄소 공급원으로 분리하기 쉽고 효과적인 방법입니다. 진균류는 리그노분해 효소인 락카제 및 퍼옥시다제(31)와 같은 세포외, 비?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 파비아 대학의 Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD)과 Solveig Tosi 교수가이 작업을위한 기회를 제공 한 것을 인정합니다.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
