Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.
Abstract
La contaminación ambiental es un problema creciente, y la identificación de hongos involucrados en el proceso de biorremediación es una tarea esencial. El suelo alberga una increíble diversidad de vida microbiana y puede ser una buena fuente de estos hongos biorremediativos. Este trabajo tiene como objetivo la búsqueda de hongos del suelo con potencial de biorremediación mediante el uso de diferentes pruebas de cribado. Los medios de cultivo minerales suplementados con sustancias recalcitrantes como única fuente de carbono se utilizaron como pruebas de crecimiento. En primer lugar, las diluciones del suelo se enchaparon en placas de Petri con medio mineral modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa. Las colonias de hongos en crecimiento se aislaron y probaron en diferentes sustratos, como mezclas complejas de hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y polvos de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Las pruebas enzimáticas cualitativas se asociaron con las pruebas de crecimiento para investigar la producción de esterasas, lacasas, peroxidasas y proteasas. Estas enzimas están involucradas en los principales procesos de degradación del material recalcitrante, y su secreción constitutiva por las cepas fúngicas examinadas podría tener el potencial de ser explotada para la biorremediación. Se aislaron y probaron más de 100 cepas, y se encontraron varios aislados con buen potencial de biorremediación. En conclusión, las pruebas de detección descritas son un método fácil y de bajo costo para identificar cepas de hongos con potencial de biorremediación del suelo. Además, es posible adaptar las pruebas de detección de diferentes contaminantes, de acuerdo con los requisitos, agregando otras sustancias recalcitrantes a los medios de cultivo mínimos.
Introduction
El suelo es un componente fundamental de la vida en la Tierra y es la base de muchos ecosistemas. Los minerales, la materia orgánica y los microorganismos en el suelo pueden considerarse como un sistema, con asociaciones e interacciones cercanas que ocurren entre ellos. Las interacciones de estos compuestos tienen un impacto importante en los procesos terrestres, la calidad ambiental y la salud de losecosistemas 1. La contaminación del suelo plantea graves problemas ambientales en todo el mundo. La aplicación indiscriminada, a largo plazo y excesiva de sustancias recalcitrantes y tóxicas, como pesticidas, productos derivados del petróleo, plásticos y otros productos químicos, tiene graves efectos en la ecología del suelo y, como resultado, puede alterar la microbiota del suelo. Las comunidades microbianas en los suelos están compuestas por una amplia gama de organismos en diferentes estados fisiológicos, siendo la mayoría bacterias y hongos. Muchos de los contaminantes en los suelos tienen estabilidad a mediano y largo plazo, y su persistencia puede conducir al desarrollo de mecanismos adaptativos que permitan a los microorganismos utilizar sustancias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Estos microorganismos pueden, por lo tanto, ser considerados para las técnicas de biorremediación.
La biorremediación trata de mitigar los efectos de la contaminación mediante el uso de microorganismos y sus enzimas para la degradación o transformación de residuos en compuestos menos tóxicos o no tóxicos. Varias especies de arqueas, bacterias, algas y hongos poseen esta capacidad de biorremediación4. Como resultado de sus particulares acciones biodegradativas, los hongos son organismos especialmente prometedores para la biorremediación. Pueden atacar diferentes sustratos utilizando su red hifal, lo que les permite penetrar en la matriz del suelo de manera más eficiente que otros microorganismos. Además, pueden alcanzar intersticios inaccesibles donde los contaminantes son difíciles de eliminar5, y también pueden sobrevivir a bajos niveles de humedad6. Además, los hongos sintetizan diferentes casetes de enzimas inespecíficas, generalmente para degradar sustancias recalcitrantes naturales como la celulosa, la lignina y los ácidos húmicos. Aquellos que carecen del sustrato objetivo pueden estar involucrados en la degradación de una amplia gama de contaminantes recalcitrantes, como hidrocarburos, plásticos y pesticidas 7,8,9,10. Por lo tanto, aunque muchas especies de hongos ya han sido reportadas como agentes de biorremediación, existe un creciente interés en explorar especies que aún no se han estudiado para seleccionar candidatos para la biorremediación de sustancias contaminantes recalcitrantes. Las especies ya conocidas por tener propiedades de biorremediación pertenecen al filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 y Mucoromycota. Por ejemplo, los géneros Penicillium y Aspergillus son bien conocidos por estar involucrados en la degradación de hidrocarburos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metales pesados19 y colorantes20. Del mismo modo, estudios realizados sobre hongos basidiomicetos, como Phanerochaete chrysosporium y Trametes versicolor, han revelado su implicación en la oxidación de materiales recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos13 y plásticos21. Otro ejemplo de hongos implicados en los procesos de biodegradación son los zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. y Cunninghamella spp.22,23. En particular, Cunninghamella es capaz de oxidar hidrocarburos aromáticos y se considera un organismo modelo para estudiar la desintoxicación de productos de una amplia gama de xenobióticos13.
Existen varias enzimas fúngicas implicadas en los principales procesos degradativos de materiales recalcitrantes 24,25, como la esterasa, la lacasa, la peroxidasa y la proteasa. Las lacasas son oxidasas que contienen cobre producidas en la célula y posteriormente secretadas, que permiten la oxidación de una variedad de compuestos fenólicos y aromáticos. Pueden degradar orto y para difenoles, los fenoles que contienen el grupo amino, la lignina y las diaminas que contienen el grupo arilo26. Las peroxidasas utilizan peróxido de hidrógeno como mediador para degradar la lignina y otros compuestos aromáticos. Hay muchas peroxidasas diferentes, pero las que tienen el mayor potencial para degradar sustancias tóxicas son la lignina peroxidasa y la manganeso peroxidasa27.
Las esterasas y proteasas pertenecen al grupo de las enzimas extracelulares o ectocelulares, que actúan fuera de sus células de origen pero que aún están unidas a ellas. Estas enzimas pueden catalizar la hidrólisis de moléculas recalcitrantes grandes en otras más pequeñas. Debido a su baja especificidad de sustrato, estas enzimas pueden desempeñar un papel clave en la biorremediación de diversos contaminantes, como colorantes textiles, efluentes liberados de las industrias de pulpa y papel y curtido de cuero, productos derivados del petróleo, plásticos y pesticidas 28,29,30.
Ya se han publicado varios métodos de cribado para seleccionar cepas fúngicas biorremediativas. Por ejemplo, el medio de agar a base de paja se ha utilizado para detectar hongos de podredumbre blanca con alto potencial en la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)31; y se han colocado pequeños trozos de madera podrida sobre agar de extracto de malta (MEA) para aislar los hongos que pudren la madera32. Sin embargo, la mayoría de los métodos que ya se han propuesto seleccionan hongos muy específicos para su actividad de interés. Esta investigación propone un enfoque más amplio para seleccionar hongos del suelo con un rango de acción más amplio. El método se basa en el recubrimiento inicial de diluciones en serie de muestras de suelo en un medio modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa mezclada con antibióticos para seleccionar hongos con la capacidad de degradar estas sustancias recalcitrantes naturales. Los ácidos húmicos y la lignocelulosa, de hecho, son sustancias que son extremadamente resistentes a la biodegradación ya que tienen estructuras moleculares muy complejas, y esto les permite ser excelentes indicadores de la capacidad degradativa de los hongos probados33,34. Posteriormente, los hongos seleccionados en las primeras pruebas se examinan para identificar aquellos con el potencial de degradar contaminantes específicos como la vaselina, el aceite de motor usado y los plásticos. Finalmente, se realizan pruebas enzimáticas cualitativas para detectar cepas fúngicas capaces de producir enzimas implicadas en los procesos de biodegradación de sustancias recalcitrantes. Para ello se realizan ensayos de proteasa y esterasa, mientras que el ácido gálico y el guaiacol se utilizan como indicadores de la producción de lacasa y otras enzimas ligninolíticas35,36. Estos sustratos se utilizan porque se ha encontrado una fuerte correlación entre la capacidad de los hongos para oxidarlos a su forma de color marrón y la posesión de la capacidad ligninolítica 37,38,39.
A través de estos protocolos, es posible aislar cepas fúngicas con alto potencial degradativo y un amplio espectro de acción directamente de muestras de suelo. El aislamiento de estas cepas fúngicas podría ayudar a encontrar nuevos candidatos para fines de biorremediación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rica biodiversidad del suelo es una fuente abundante de hongos que poseen numerosas capacidades metabólicas, algunas de las cuales podrían ser candidatos potenciales para la biorremediación. Las pruebas selectivas de medios (Sección 1 del protocolo) son métodos fáciles de realizar y efectivos para aislar hongos capaces de crecer en polímeros complejos naturales como su única fuente de carbono. Los hongos pueden producir hidrolasas extracelulares, inespecíficas y oxidorreductasas30 como…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos a la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de la Universidad de Pavía y al profesor Solveig Tosi por brindar la oportunidad de este trabajo.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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