難治性物質の分解に関与する菌類の土壌生物多様性からの単離とスクリーニング
Summary
ここでは、土壌生物多様性をスクリーニングして、不本意な物質の分解に関与する真菌株を探すためのプロトコルを提示する。まず、フミン酸またはリグノセルロース上で増殖することができる真菌株が単離される。その後、それらの活性は酵素アッセイと炭化水素やプラスチックなどの汚染物質の両方でテストされます。
Abstract
環境汚染はますます大きな問題となっており、バイオレメディエーションプロセスに関与する真菌を特定することは不可欠な課題です。土壌は信じられないほど多様な微生物を宿主とし、これらのバイオレメディエーション菌類の良い供給源となり得ます。本研究は、異なるスクリーニング試験を用いて、バイオレメディエーションの可能性を秘めた土壌菌類の探索を目指している。唯一の炭素源として難治性物質を添加したミネラル培養培地を増殖試験として用いた。まず、土壌希釈物を、フミン酸またはリグノセルロースで修正したミネラル培地でペトリ皿に播種した。増殖中の真菌コロニーを単離し、炭化水素(ワセリンおよび使用済みモーターオイル)の複雑な混合物および異なるプラスチックポリマー(PET、PP、PS、PUR、PVC)の粉末などの異なる基質上で試験した。定性酵素試験は、エステラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、およびプロテアーゼの産生を調査するための成長試験と関連していた。これらの酵素は、不屈物質の主な分解プロセスに関与しており、検査された真菌株によるそれらの構成的分泌は、バイオレメディエーションのために利用される可能性がある。100以上の菌株を単離して試験し、良好なバイオレメディエーションの可能性を有するいくつかの分離株が見出された。結論として、記載されたスクリーニング試験は、土壌からバイオレメディエーションの可能性を有する真菌株を同定するための簡単で低コストの方法である。さらに、最小限の培養培地に他の不応物質を添加することにより、要件に応じて、異なる汚染物質のスクリーニング試験を調整することが可能である。
Introduction
土壌は地球上の生命の基本的な構成要素であり、多くの生態系の基礎となっています。土壌中の鉱物、有機物、微生物は、密接な関係と相互作用が起こっている1つのシステムと考えることができます。これらの化合物の相互作用は、陸域のプロセス、環境の質、生態系の健全性に重要な影響を与えます1。土壌汚染は、世界中で深刻な環境問題を引き起こしています。農薬、石油製品、プラスチック、その他の化学物質などの反抗的および有毒物質の無差別、長期、および過剰な適用は、土壌生態学に深刻な影響を及ぼし、その結果、土壌微生物叢を変化させる可能性があります。土壌中の微生物群集は、異なる生理学的状態の広範囲の生物で構成されており、その大部分は細菌および真菌である。土壌中の汚染物質の多くは中長期的に安定性を有し、その持続性は微生物が不本意な物質を栄養素として利用することを可能にする適応メカニズムの開発につながる可能性がある2,3。したがって、これらの微生物は、バイオレメディエーション技術のために考慮することができる。
バイオレメディエーションは、廃棄物を毒性の低いまたは無毒な化合物に分解または変換するために微生物およびその酵素を使用することによって、汚染の影響を緩和しようとします。古細菌、細菌、藻類、および真菌の様々な種は、このバイオレメディエーション能力4を有する。それらの特定の生分解作用の結果として、真菌はバイオレメディエーションのために特に有望な生物である。彼らは彼らの菌糸ネットワークを使って異なる基質を攻撃することができ、他の微生物よりも効率的に土壌マトリックスに浸透することを可能にします。さらに、汚染物質を除去するのが難しいアクセスできない隙間に到達する可能性があり5、低水分レベル6でも生き残ることができます。さらに、真菌は、非特異的酵素の異なるカセットを合成し、通常、セルロース、リグニン、およびフミン酸などの天然の反抗物質を分解する。標的基質を欠いているものは、炭化水素、プラスチック、および農薬7、8、9、10などの広範囲の残留性汚染物質の分解に関与する可能性がある。そのため、バイオレメディエーション剤として既に多くの真菌種が報告されているが、難治性汚染物質のバイオレメディエーションの候補を選択するために未だ研究されていない種を探索することへの関心が高まっている。バイオレメディエーション特性を有することが既に知られている種は、子嚢菌11、12、13、担子菌14、15、およびケコロマイコタ属に属する。例えば、ペニシリウム属およびアスペルギルス属は、脂肪族炭化水素13、異なるプラスチックポリマー16、17、18、重金属19、および染料20の分解に関与することがよく知られている。同様に、Phanerochaete chrysosporiumやTrametes versicolorなどの担子菌類の真菌について行われた研究は、芳香族炭化水素13およびプラスチック21などの難治性物質の酸化への関与を明らかにしている。生分解プロセスに関与する真菌の別の例は、接合菌類Rhizopus spp.、Mucor spp.、およびCunninghamella spp.22,23である。特に、クニンガメラは芳香族炭化水素を酸化酵素することができ、広範囲の生体異物13からの生成物の無害化を研究するためのモデル生物と考えられている。
エステラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、およびプロテアーゼなどの難解な物質24、25の主要な分解プロセスに関与するいくつかの真菌酵素がある。ラッカーゼは、細胞内で産生され、その後分泌される銅含有オキシダーゼであり、様々なフェノール化合物および芳香族化合物の酸化を可能にする。これらは、オルトおよびパラジフェノール、アミノ基含有フェノール、リグニン、およびアリール基含有ジアミン26を分解することができる。ペルオキシダーゼは、リグニンおよび他の芳香族化合物を分解するためのメディエーターとして過酸化水素を使用する。ペルオキシダーゼには多くの種類がありますが、有害物質を分解する可能性が最も高いのはリグニンペルオキシダーゼとマンガンペルオキシダーゼ27です。
エステラーゼおよびプロテアーゼは、細胞外または外部細胞酵素のグループに属し、それらは起源の細胞外で作用するが、依然としてそれらに結合している。これらの酵素は、大きな反抗分子の加水分解をより小さな分子に触媒することができる。基質特異性が低いため、これらの酵素は、繊維染料、パルプおよび製紙産業から放出される廃液、皮革なめし、石油製品、プラスチック、および農薬などの様々な汚染物質のバイオレメディエーションにおいて重要な役割を果たすことができる28,29,30。
生体修復真菌株について選択するための多数のスクリーニング方法が既に公開されている。例えば、ストロー系寒天培地は、多環芳香族炭化水素(PAH)分解物31において高い電位を有する白色腐朽菌のスクリーニングに用いられてきた;腐った木材の小片を麦芽エキス寒天(MEA)の上に置き、木材腐朽菌32を単離した。しかしながら、既に提案されている方法のほとんどは、関心のあるそれらの活性のために非常に特異的な真菌を選択する。本研究は、より広範囲の作用を有する土壌菌類を選択するためのより広範なアプローチを提案する。この方法は、土壌サンプルの段階希釈物を抗生物質と混合したフミン酸またはリグノセルロースで修正した培地に初期メッキすることに依存し、これらの天然の反抗物質を分解する能力を有する真菌を選択する。フミン酸およびリグノセルロースは、実際には、非常に複雑な分子構造を有するので生分解に対して非常に耐性のある物質であり、これはそれらが試験された真菌の分解能力の優れた指標であることを可能にする33,34。その後、最初の試験で選択された真菌をスクリーニングして、ワセリン、使用済みエンジンオイル、プラスチックなどの特定の汚染物質を分解する可能性のある真菌を特定します。最後に、定性酵素試験は、反抗的な物質の生分解プロセスに関与する酵素を産生することができる真菌株を検出するために行われる。この目的のために、プロテアーゼおよびエステラーゼ試験が行われ、没食子酸およびグアイアコールがラッカーゼおよび他のリグニ分解酵素産生の指標として使用される35,36。これらの基質が使用されるのは、真菌がそれらを茶色に酸化する能力とリグニノライシス能力の保有との間に強い相関関係が見出されたからである37,38,39。
これらのプロトコールを通じて、土壌サンプルから直接、高い分解可能性および広範囲の作用スペクトルを有する真菌株を単離することが可能である。これらの真菌株の単離は、バイオレメディエーション目的の新しい候補を見つけるのに役立つ可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
土壌の豊かな生物多様性は、多数の代謝能力を有する真菌の豊富な供給源であり、そのうちのいくつかはバイオレメディエーションの潜在的な候補となり得る。選択的培地試験(プロトコルのセクション1)は、天然の複合ポリマー上で増殖可能な真菌を唯一の炭素源として単離するための、実行が容易で効果的な方法です。真菌は、リグニノリグ溶解酵素ラクケースおよびペルオキシダーゼ<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、パヴィア大学のスクオーラ・ディ・アルタ・フォルマツィオーネ・ドットラーレ(SAFD)及びソルヴェイグ・トシ教授がこの研究の機会を提供してくれたことを認める。
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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