İnatçı Malzemelerin Parçalanmasında Rol Oynayan Mantarlar için Toprak Biyoçeşitliliğinden İzolasyon ve Tarama
Summary
Burada, inatçı materyallerin parçalanmasında rol oynayan mantar suşlarını aramak için toprak biyoçeşitliliğini taramak için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, hümik asitler veya lignoselüloz üzerinde büyüyebilen mantar suşları izole edilir. Aktiviteleri daha sonra hem enzimatik testlerde hem de hidrokarbonlar ve plastikler gibi kirleticiler üzerinde test edilir.
Abstract
Çevre kirliliği giderek artan bir sorundur ve biyoremediasyon sürecinde yer alan mantarları tanımlamak önemli bir görevdir. Toprak, inanılmaz bir mikrobiyal yaşam çeşitliliğine ev sahipliği yapar ve bu biyoremediatif mantarların iyi bir kaynağı olabilir. Bu çalışma, farklı tarama testleri kullanarak biyoremediasyon potansiyeli olan toprak mantarlarını araştırmayı amaçlamaktadır. Tek karbon kaynağı olarak inatçı maddelerle desteklenen mineral kültür ortamları büyüme testleri olarak kullanılmıştır. İlk olarak, toprak seyreltmeleri Petri kaplarına hümik asitler veya lignoselüloz ile değiştirilmiş mineral ortam ile kaplandı. Büyüyen mantar kolonileri, hidrokarbonların karmaşık karışımları (petrolatum ve kullanılmış motor yağı) ve farklı plastik polimerlerin tozları (PET, PP, PS, PUR, PVC) gibi farklı substratlar üzerinde izole edildi ve test edildi. Kalitatif enzimatik testler, esterazların, lakkazların, peroksidazların ve proteazların üretimini araştırmak için büyüme testleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu enzimler, inatçı materyalin ana bozunma süreçlerinde rol oynar ve incelenen mantar suşları tarafından yapısal sekresyonları, biyoremediasyon için kullanılma potansiyeline sahip olabilir. 100’den fazla suş izole edildi ve test edildi ve iyi biyoremediasyon potansiyeline sahip birkaç izolat bulundu. Sonuç olarak, tarif edilen tarama testleri, topraktan biyoremediasyon potansiyeli olan mantar suşlarını tanımlamak için kolay ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Ek olarak, farklı kirleticiler için tarama testlerini, gereksinimlere göre, minimum kültür ortamına diğer inatçı maddeler ekleyerek uyarlamak mümkündür.
Introduction
Toprak, Dünya üzerindeki yaşamın temel bir bileşenidir ve birçok ekosistemin temelidir. Topraktaki mineraller, organik maddeler ve mikroorganizmalar, aralarında meydana gelen yakın ilişkiler ve etkileşimlerle tek bir sistem olarak düşünülebilir. Bu bileşiklerin etkileşimleri karasal süreçler, çevresel kalite ve ekosistem sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1. Toprak kirliliği dünya çapında ciddi çevre sorunları oluşturmaktadır. Pestisitler, petrol ürünleri, plastikler ve diğer kimyasallar gibi inatçı ve toksik maddelerin ayrım gözetmeksizin, uzun süreli ve aşırı uygulanmasının toprak ekolojisi üzerinde ciddi etkileri vardır ve sonuç olarak toprak mikrobiyotasını değiştirebilir. Topraklardaki mikrobiyal topluluklar, çoğunluğu bakteri ve mantar olmak üzere farklı fizyolojik durumlarda çok çeşitli organizmalardan oluşur. Topraklardaki kirleticilerin çoğu orta ila uzun vadeli stabiliteye sahiptir ve kalıcılıkları, mikroorganizmaların inatçı maddeleri besin maddesi olarak kullanmalarına izin veren uyarlanabilir mekanizmaların gelişmesine yol açabilir 2,3. Bu nedenle, bu mikroorganizmalar biyoremediasyon teknikleri için düşünülebilir.
Bioremediasyon, atıkların daha az toksik veya toksik olmayan bileşiklere parçalanması veya dönüştürülmesi için mikroorganizmaları ve enzimlerini kullanarak kirliliğin etkilerini azaltmaya çalışır. Çeşitli arke, bakteri, alg ve mantar türleri bu biyoremediasyon yeteneğinesahiptir 4. Özel biyodegradatif etkilerinin bir sonucu olarak, mantarlar özellikle biyoremediasyon için umut verici organizmalardır. Hifal ağlarını kullanarak farklı substratlara saldırabilirler, bu da toprak matrisine diğer mikroorganizmalardan daha verimli bir şekilde nüfuz etmelerini sağlar. Ek olarak, kirleticilerin çıkarılmasının zor olduğu erişilemez ara noktalara ulaşabilirler5 ve ayrıca düşük nem seviyelerinde hayatta kalabilirler6. Dahası, mantarlar genellikle selüloz, lignin ve hümik asitler gibi doğal inatçı maddeleri parçalamak için spesifik olmayan enzimlerin farklı kasetlerini sentezler. Hedef substrattan yoksun olanlar, hidrokarbonlar, plastikler ve pestisitler 7,8,9,10 gibi çok çeşitli inatçı kirleticilerin bozulmasına karışabilir. Bu nedenle, birçok mantar türü zaten biyoremediasyon ajanları olarak bildirilmiş olmasına rağmen, inatçı kirletici maddelerin biyoremediasyonu için adayları seçmek için henüz çalışılmamış türlerin araştırılmasına olan ilgi artmaktadır. Biyoremediasyon özelliklerine sahip olduğu bilinen türler, filum Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 ve Mucoromycota’ya aittir. Örneğin, Penicillium ve Aspergillus cinslerinin, alifatik hidrokarbonların13, farklı plastik polimerlerin 16,17,18, ağır metallerin19 ve boyaların20’nin parçalanmasında rol oynadığı iyi bilinmektedir. Benzer şekilde, Phanerochaete chrysosporium ve Trametes versicolor gibi bazidiomycetes mantarları üzerinde yapılan çalışmalar, aromatik hidrokarbonlar13 ve plastikler21 gibi inatçı malzemelerin oksidasyonuna katılımlarını ortaya koymuştur. Biyodegradasyon işlemlerinde yer alan mantarların bir başka örneği de zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. ve Cunninghamella spp.22,23’tür. Özellikle, Cunninghamella aromatik hidrokarbonları oksidaz edebilir ve çok çeşitli ksenobiyotiklerden ürünlerin detoksifikasyonunu incelemek için model bir organizma olarak kabul edilir13.
Esteraz, lakkaz, peroksidaz ve proteaz gibi inatçı materyallerin 24,25 ana degradatif süreçlerinde yer alan birkaç mantar enzimi vardır. Lakkazlar, hücrede üretilen ve daha sonra salgılanan, çeşitli fenolik ve aromatik bileşiklerin oksidasyonuna izin veren bakır içeren oksidazlardır. Orto ve para difenollerini, amino grubu içeren fenolleri, ligninleri ve aril grubu içeren diaminleri26 parçalayabilirler. Peroksidazlar, lignin ve diğer aromatik bileşikleri parçalamak için bir aracı olarak hidrojen peroksit kullanır. Birçok farklı peroksidaz vardır, ancak toksik maddeleri bozma potansiyeli en yüksek olanlar lignin peroksidaz ve manganez peroksidaz27’dir.
Ezarazlar ve proteazlar, menşe hücrelerinin dışında hareket eden, ancak yine de onlara bağlı olan hücre dışı veya ekto-hücresel enzimler grubuna aittir. Bu enzimler, büyük inatçı moleküllerin hidrolizini daha küçük olanlara katalize edebilir. Düşük substrat özgüllükleri nedeniyle, bu enzimler tekstil boyaları, kağıt hamuru ve kağıt endüstrilerinden salınan atık sular ve deri tabaklama, petrol ürünleri, plastikler ve pestisitler gibi çeşitli kirleticilerin biyoremediasyonunda önemli bir rol oynayabilir28,29,30.
Biyoremediatif mantar suşları için seçilecek bir dizi tarama yöntemi zaten yayınlanmıştır. Örneğin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) bozunmasında yüksek potansiyele sahip beyaz çürük mantarları taramak için saman bazlı agar ortamı kullanılmıştır31; ve odun çürüyen mantarları izole etmek için malt özü agar (MEA) üzerine küçük çürüyen odun parçaları yerleştirilmiştir32. Bununla birlikte, daha önce önerilen yöntemlerin çoğu, ilgilendikleri aktivite için çok spesifik mantarlar seçmektedir. Bu araştırma, daha geniş bir etki alanına sahip toprak mantarlarını seçmek için daha geniş bir yaklaşım önermektedir. Yöntem, toprak örneklerinin seri seyreltmelerinin, bu doğal inatçı maddeleri bozma kabiliyetine sahip mantarları seçmek için antibiyotiklerle karıştırılmış hümik asitler veya lignoselüloz ile değiştirilmiş bir ortam üzerine ilk kaplanmasına dayanır. Hümik asitler ve lignoselüloz, aslında, çok karmaşık moleküler yapılara sahip oldukları için biyolojik bozunmaya karşı son derece dirençli maddelerdir ve bu, test edilen mantarların bozunma kabiliyetinin mükemmel göstergeleri olmalarını sağlar33,34. Daha sonra, ilk testlerde seçilen mantarlar, petrolatum, kullanılmış motor yağı ve plastikler gibi spesifik kirleticileri parçalama potansiyeline sahip olanları belirlemek için taranır. Son olarak, inatçı maddelerin biyolojik bozunma işlemlerinde yer alan enzimleri üretebilen mantar suşlarını tespit etmek için kalitatif enzimatik testler yapılır. Bu amaçla proteaz ve esteraz testleri yapılırken, lakkaz ve diğer lininolitik enzim üretiminin göstergeleri olarak gallik asit ve guaiakol kullanılmaktadır35,36. Bu substratlar kullanılır, çünkü mantarların onları kahverengi renkli formlarına oksitleme kabiliyeti ile lininolitik kabiliyete sahip olma arasında güçlü bir korelasyon bulunmuştur37,38,39.
Bu protokoller sayesinde, yüksek bozunma potansiyeline ve geniş bir etki spektrumuna sahip mantar suşlarını doğrudan toprak örneklerinden izole etmek mümkündür. Bu mantar suşlarının izolasyonu, biyoremediasyon amaçları için yeni adaylar bulmaya yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toprağın zengin biyolojik çeşitliliği, bazıları biyoremediasyon için potansiyel adaylar olabilecek çok sayıda metabolik yeteneğe sahip bol miktarda mantar kaynağıdır. Seçici ortam testleri (protokolün 1. Bölümü), tek karbon kaynağı olarak doğal kompleks polimerler üzerinde büyüyebilen mantarları izole etmek için gerçekleştirilmesi kolay ve etkili yöntemlerdir. Mantarlar, ligninolitik enzimler lakkazlar ve peroksidazlar31 gibi hücre dışı, spesifik olmayan hidrolazl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pavia Üniversitesi’nden Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) ve Profesör Solveig Tosi’ye bu çalışma için fırsat sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
References
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
- Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
- Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation – A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
- Dix, N. J., Webster, J. . Fungal Ecology. , (1995).
- Magan, N., Esser, K., Lemke, P. A. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. 4, 99-114 (2007).
- Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
- Hasan, I. F., AI-Jawhari, V., Kumar, M., Kumar, R., Prasad, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. , (2018).
- Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
- Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
- Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
- Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
- Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 1-36 (2018).
- Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig’s Corrosion Handbook. , 421-438 (2011).
- Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, 224-239 (2019).
- DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
- El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
- Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
- Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
- Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
- Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
- Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
- Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
- Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , (2019).
- Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
- Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , (2019).
- Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
- Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
- Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
- Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
- Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
- Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
- Stevenson, F. J. . Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , (1995).
- Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
- Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
- Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
- Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
- Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
- Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
- Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
- Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
- Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
- Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
- Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).
