Isolierung und Screening aus der Bodenbiodiversität auf Pilze, die am Abbau widerspenstiger Materialien beteiligt sind

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening der Bodenbiodiversität vor, um nach Pilzstämmen zu suchen, die am Abbau von widerspenstigen Materialien beteiligt sind. Zuerst werden Pilzstämme, die auf Huminsäuren oder Lignocellulose wachsen können, isoliert. Ihre Aktivität wird dann sowohl in enzymatischen Assays als auch an Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen und Kunststoffen getestet.

Abstract

Umweltverschmutzung ist ein zunehmendes Problem, und die Identifizierung von Pilzen, die am Bioremediationsprozess beteiligt sind, ist eine wesentliche Aufgabe. Der Boden beherbergt eine unglaubliche Vielfalt an mikrobiellem Leben und kann eine gute Quelle für diese bioremediativen Pilze sein. Diese Arbeit zielt darauf ab, nach Bodenpilzen mit Bioremediationspotenzial zu suchen, indem verschiedene Screening-Tests verwendet werden. Als Wachstumstests wurden mineralische Kulturmedien verwendet, die mit widerspenstigen Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle ergänzt wurden. Zunächst wurden Bodenverdünnungen auf Petrischalen mit mineralischem Medium plattiert, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose versetzt war. Die wachsenden Pilzkolonien wurden isoliert und auf verschiedenen Substraten getestet, wie komplexen Mischungen von Kohlenwasserstoffen (Petrolatum und gebrauchtes Motorenöl) und Pulvern verschiedener Kunststoffpolymere (PET, PP, PS, PUR, PVC). Qualitative enzymatische Tests wurden mit den Wachstumstests verbunden, um die Produktion von Esterasen, Laccases, Peroxidasen und Proteasen zu untersuchen. Diese Enzyme sind an den Hauptabbauprozessen von widerspenstigem Material beteiligt, und ihre konstitutive Sekretion durch die untersuchten Pilzstämme könnte das Potenzial haben, für die Bioremediation genutzt zu werden. Mehr als 100 Stämme wurden isoliert und getestet, und es wurden mehrere Isolate mit gutem Bioremediationspotenzial gefunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebenen Screening-Tests eine einfache und kostengünstige Methode sind, um Pilzstämme mit Bioremediationspotenzial aus dem Boden zu identifizieren. Darüber hinaus ist es möglich, die Screening-Tests für verschiedene Schadstoffe je nach Bedarf anzupassen, indem anderen widerspenstigen Substanzen Minimalkulturmedien zugesetzt werden.

Introduction

Der Boden ist ein grundlegender Bestandteil des Lebens auf der Erde und die Grundlage vieler Ökosysteme. Die Mineralien, organischen Stoffe und Mikroorganismen im Boden können als ein System betrachtet werden, wobei enge Assoziationen und Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Die Wechselwirkungen dieser Verbindungen haben einen wichtigen Einfluss auf terrestrische Prozesse, die Umweltqualität und die Gesundheit des Ökosystems¹. Die Bodenverschmutzung stellt weltweit ernste Umweltprobleme dar. Die wahllose, langfristige und übermäßige Anwendung von widerspenstigen und toxischen Substanzen wie Pestiziden, Erdölprodukten, Kunststoffen und anderen Chemikalien hat schwerwiegende Auswirkungen auf die Bodenökologie und kann infolgedessen die Mikrobiota des Bodens verändern. Mikrobielle Gemeinschaften in Böden bestehen aus einer Vielzahl von Organismen in verschiedenen physiologischen Zuständen, wobei die Mehrheit Bakterien und Pilze sind. Viele der Schadstoffe in Böden haben eine mittel- bis langfristige Stabilität, und ihre Persistenz kann zur Entwicklung adaptiver Mechanismen führen, die es den Mikroorganismen ermöglichen, widerspenstige Substanzen als Nährstoffe zu verwenden ^2,3. Diese Mikroorganismen können daher für Bioremediationstechniken in Betracht gezogen werden.

Bioremediation versucht, die Auswirkungen der Umweltverschmutzung zu mildern, indem Mikroorganismen und ihre Enzyme für den Abbau oder die Umwandlung von Abfällen in weniger toxische oder ungiftige Verbindungen verwendet werden. Verschiedene Arten von Archaeen, Bakterien, Algen und Pilzen besitzen diese Bioremediationsfähigkeit⁴. Aufgrund ihrer besonderen biologisch abbaubaren Wirkung sind Pilze besonders vielversprechende Organismen für die Bioremediation. Sie können verschiedene Substrate mit ihrem Hyphennetzwerk angreifen, wodurch sie effizienter in die Bodenmatrix eindringen können als andere Mikroorganismen. Darüber hinaus können sie unzugängliche Zwischenräume erreichen, an denen Verunreinigungen schwer zu entfernen sind⁵, und sie können auch niedrige Feuchtigkeitswerte^{überleben 6}. Darüber hinaus synthetisieren Pilze verschiedene Kassetten unspezifischer Enzyme, in der Regel, um natürliche widerspenstige Substanzen wie Cellulose, Lignin und Huminsäuren abzubauen. Diejenigen, denen das Zielsubstrat fehlt, können am Abbau einer Vielzahl von widerspenstigen Schadstoffen wie Kohlenwasserstoffen, Kunststoffen und Pestiziden beteiligt sein 7,8,9,10. Obwohl bereits viele Pilzarten als Bioremediationsmittel gemeldet wurden, steigt das Interesse an der Erforschung von Arten, die noch nicht untersucht wurden, um Kandidaten für die Bioremediation von widerspenstigen kontaminierenden Substanzen auszuwählen. Die Arten, von denen bereits bekannt ist, dass sie Bioremediationseigenschaften haben, gehören zu den Stämmen Ascomycota 11,12,13, ^{Basidiomycota 14,15} und Mucoromycota. Zum Beispiel sind die Gattungen Penicillium und Aspergillus bekanntermaßen am Abbau von aliphatischen Kohlenwasserstoffen 13, verschiedenen Kunststoffpolymeren^16,17,18, Schwermetallen ¹⁹ und Farbstoffen²⁰ beteiligt. In ähnlicher Weise haben Studien, die an Basidiomycetes-Pilzen wie Phanerochaete Chrysosporium und Trametes versicolor durchgeführt wurden, ihre Beteiligung an der Oxidation von widerspenstigen Materialien wie aromatischen Kohlenwasserstoffen¹³ und Kunststoffen²¹ gezeigt. Ein weiteres Beispiel für Pilze, die an den biologischen Abbauprozessen beteiligt sind, sind die Zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. und Cunninghamella spp.22,23. Insbesondere Cunninghamella ist in der Lage, aromatische Kohlenwasserstoffe zu oxidieren und gilt als Modellorganismus für die Untersuchung der Entgiftung von Produkten aus einer breiten Palette von Xenobiotika¹³.

Es gibt mehrere Pilzenzyme, die an den wichtigsten Abbauprozessen von widerspenstigen Materialien^{beteiligt sind 24,25, wie} Esterase, Laccase^, Peroxidase und Protease. Laccasen sind kupferhaltige Oxidasen, die in der Zelle produziert und anschließend sezerniert werden, die die Oxidation einer Vielzahl von phenolischen und aromatischen Verbindungen ermöglichen. Sie können Ortho- und Paradiphenole, die aminogruppenhaltigen Phenole, Lignin und die Arylgruppen-haltigen Diamine²⁶ abbauen. Peroxidasen verwenden Wasserstoffperoxid als Mediator, um Lignin und andere aromatische Verbindungen abzubauen. Es gibt viele verschiedene Peroxidasen, aber diejenigen mit dem größten Potenzial, toxische Substanzen abzubauen, sind Ligninperoxidase und Manganperoxidase²⁷.

Esterasen und Proteasen gehören zur Gruppe der extra- oder ektozellulären Enzyme, die außerhalb ihrer Ursprungszellen wirken, aber dennoch an sie gebunden sind. Diese Enzyme können die Hydrolyse großer widerspenstiger Moleküle in kleinere katalysieren. Aufgrund ihrer geringen Substratspezifität können diese Enzyme eine Schlüsselrolle bei der Bioremediation verschiedener Schadstoffe wie Textilfarbstoffe, Abwässer aus der Zellstoff- und Papierindustrie und Ledergerbung, Erdölprodukte, Kunststoffe und Pestizide^{spielen 28,29,30}.

Eine Reihe von Screening-Methoden zur Auswahl für bioremediative Pilzstämme wurde bereits veröffentlicht. Zum Beispiel wurde Agarmedium auf Strohbasis verwendet, um nach Weißfäulepilzen mit hohem Potenzial im Abbau polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAK) zu suchen³¹; und kleine Stücke von verrottendem Holz wurden auf Malzextraktagar (MEA) gelegt, um holzverrottende Pilze³² zu isolieren. Die meisten der bereits vorgeschlagenen Methoden wählen jedoch sehr spezifische Pilze für ihre interessierende Aktivität aus. Diese Forschung schlägt einen breiteren Ansatz für die Auswahl von Bodenpilzen mit einem breiteren Wirkungsspektrum vor. Die Methode beruht auf der anfänglichen Beschichtung von seriellen Verdünnungen von Bodenproben auf ein Medium, das mit Huminsäuren oder Lignocellulose, gemischt mit Antibiotika, modifiziert ist, um Pilze auszuwählen, die diese natürlichen widerspenstigen Substanzen abbauen können. Huminsäuren und Lignocellulose sind in der Tat Substanzen, die extrem resistent gegen biologischen Abbau sind, da sie sehr komplexe molekulare Strukturen haben, und dies ermöglicht es ihnen, ausgezeichnete Indikatoren für die Abbaufähigkeit der getesteten Pilze^{zu sein 33,34}. Anschließend werden die in den ersten Tests ausgewählten Pilze untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die das Potenzial haben, bestimmte Schadstoffe wie Petrolatum, gebrauchtes Motoröl und Kunststoffe abzubauen. Schließlich werden qualitative enzymatische Tests durchgeführt, um Pilzstämme nachzuweisen, die in der Lage sind, Enzyme zu produzieren, die an den biologischen Abbauprozessen widerspenstiger Substanzen beteiligt sind. Zu diesem Zweck werden Protease- und Esterasetests durchgeführt, während Gallussäure und Guajakol als Indikatoren für die Produktion von Laccase- und anderen ligninolytischen Enzymen^{verwendet werden 35,36}. Diese Substrate werden verwendet, weil eine starke Korrelation zwischen der Fähigkeit von Pilzen, sie zu ihrer braunen Form zu oxidieren, und dem Besitz der ligninolytischen Fähigkeit^37,38,39 gefunden wurde.

Durch diese Protokolle ist es möglich, Pilzstämme mit hohem Abbaupotenzial und einem breiten Wirkungsspektrum direkt aus Bodenproben zu isolieren. Die Isolierung dieser Pilzstämme könnte dazu beitragen, neue Kandidaten für die Bioremediation zu finden.

Protocol

1. Auswahl von Pilzstämmen, die in der Lage sind, widerspenstige Materialien aus dem Boden abzubauen Herstellung von antibiotischer Lösung. Penicillin (50 mg / L), Streptomycin (40 mg / L), Chlortetracyclin (40 mg / L), Neomycin (100 mg / L) und Chloramphenicol (100 mg / L) in 250 ml deionisiertes steriles Wasser. Bevor Sie Chloramphenicol in die antibiotische Lösung geben, lösen Sie es in 3 ml ≥99% Ethanol auf. Legen Sie die antibiotische Lösung für 10 min…

Representative Results

Die selektiven Medienmethoden (Abschnitt 1 des Protokolls) ermöglichten es, die reiche Biodiversität des Bodens zu untersuchen und die Pilze mit hohem Bioremediationspotenzial auszuwählen. Mit den Huminsäure- und Lignocellulosemedien wurden mehr als 100 Pilzstämme isoliert. Diese Pilze produzierten Enzyme, die am biologischen Abbau von natürlichen widerspenstigen Materialien beteiligt sind, die eine chemische Struktur haben, die vielen Schadstoffen ähnelt. Die mit den selektiven Medien isolierten Pilzstämme musst…

Discussion

Die reiche Artenvielfalt des Bodens ist eine reichhaltige Quelle von Pilzen, die zahlreiche metabolische Fähigkeiten besitzen, von denen einige potenzielle Kandidaten für die Bioremediation sein könnten. Selektive Medientests (Abschnitt 1 des Protokolls) sind einfach durchzuführende und wirksame Methoden zur Isolierung von Pilzen, die auf natürlichen komplexen Polymeren als einzige Kohlenstoffquelle wachsen können. Pilze können extrazelluläre, unspezifische Hydrolasen und Oxidoreduktasen³⁰…

Materials

96 microwell plate	Greiner bio-one	650185
Agar	VWR	84609.05
Bushnell-Haas Broth	Fluka	B5051
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Chloroamphenicol	Eurobio	GABCRL006Z
Chlortetracycline	Sigma-Aldrich	Y0001451
CoCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
CuCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3279
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
FeCl3·6H2O	Sigma-Aldrich	236489
Filter 0.2 µm	Whatman	10462200
gallic acid	Sigma-Aldrich	G7384
Glass cover slips	Biosigma	VBS634
Glass vials 15 mL	SciLabware	P35467
guaiacol	Sigma-Aldrich	G5502
High-density polyethylene (HDPE)	Sigma-Aldrich	434272
Humic acids	Aldrich Chemistry	53680
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P8281
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Lignocellulose	/	/	Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader	Laboindustria S.p.a	21133
magnetic stirrer	A.C.E.F	8235
Malt Extract Broth	Sigma-Aldrich	70146
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M2643
Micropipette 1000 μL	Gilson	FA10006M
Micropipette 200  μL	Gilson	FA10005M
MnCl2·4H2O	Sigma-Aldrich	M5005
Na2MoO4·2H2O	Sigma-Aldrich	M1651
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neomycin	Sigma-Aldrich	N0401000
Penicillin	Sigma-Aldrich	1504489
peptone	Sigma-Aldrich	83059
Polyethylene terephthalate (PET)	Goodfellow	ES306031
Petri dishes	Laboindustria S.p.a	21050
Petrolatum (Paraffin liquid)	A.C.E.F	009661
Potato Dextrose Broth	Sigma-Aldrich	P6685
Polystyrene (PS)	Sigma-Aldrich	331651
Polyurethane (PUR)	Sigma-Aldrich	GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC)	Sigma-Aldrich	81388
Sterile falcon tube	Greiner bio-one	227 261
Sterile glass vials 20 mL	Sigma-Aldrich	SU860051
Sterile point 1000  μL	Gilson	F172511
Sterile point 200  μL	Gilson	F172311
Sterile polyethylene bags	WHIRL-PAK	B01018
sterile syringe	Rays	5523CM25
Streptomycin	Sigma-Aldrich	S-6501
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754
Used engine oil	/	/	complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL	Sigma-Aldrich	33108-U
ZnCl2	Sigma-Aldrich	Z0152