अलगाव और कवक के लिए मिट्टी जैव विविधता से स्क्रीनिंग अड़ियल सामग्री के क्षरण में शामिल
Summary
यहां, हम मिट्टी की जैव विविधता की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि अड़ियल सामग्री के क्षरण में शामिल कवक उपभेदों की तलाश की जा सके। सबसे पहले, ह्यूमिक एसिड या लिग्नोसेल्युलोज पर बढ़ने में सक्षम कवक उपभेदों को अलग किया जाता है। उनकी गतिविधि तब एंजाइमेटिक assays और हाइड्रोकार्बन और प्लास्टिक जैसे प्रदूषकों दोनों में परीक्षण किया जाता है।
Abstract
पर्यावरण प्रदूषण एक बढ़ती हुई समस्या है, और बायोरेमेडिएशन प्रक्रिया में शामिल कवक की पहचान करना एक आवश्यक कार्य है। मिट्टी माइक्रोबियल जीवन की एक अविश्वसनीय विविधता की मेजबानी करती है और इन बायोरेमेडिएटिव कवक का एक अच्छा स्रोत हो सकती है। इस काम का उद्देश्य विभिन्न स्क्रीनिंग परीक्षणों का उपयोग करके बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ मिट्टी कवक की खोज करना है। खनिज संस्कृति मीडिया एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में अड़ियल पदार्थों के साथ पूरक विकास परीक्षणों के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सबसे पहले, मिट्टी के dilutions humic एसिड या lignocellulose के साथ संशोधित खनिज माध्यम के साथ पेट्री व्यंजनपर मढ़वाया गया था। बढ़ती कवक कॉलोनियों को अलग-थलग कर दिया गया था और विभिन्न सब्सट्रेट्स पर परीक्षण किया गया था, जैसे हाइड्रोकार्बन के जटिल मिश्रण (पेट्रोलेटम और इस्तेमाल किए गए मोटर तेल) और विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर (पीईटी, पीपी, पीएस, पीयूआर, पीवीसी) के पाउडर। गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षणों को एस्टेरेस, लैक्केस, पेरोक्सीडेस और प्रोटीज के उत्पादन की जांच करने के लिए विकास परीक्षणों से जोड़ा गया था। ये एंजाइम अड़ियल सामग्री की मुख्य गिरावट प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और जांच किए गए कवक उपभेदों द्वारा उनके संरचनात्मक स्राव में बायोरेमेडिएशन के लिए शोषण करने की क्षमता हो सकती है। 100 से अधिक उपभेदों को अलग किया गया और परीक्षण किया गया, और अच्छी बायोरेमेडिएशन क्षमता वाले कई आइसोलेट्स पाए गए। अंत में, वर्णित स्क्रीनिंग परीक्षण मिट्टी से बायोरेमेडिएशन क्षमता के साथ कवक उपभेदों की पहचान करने के लिए एक आसान और कम लागत वाली विधि है। इसके अलावा, आवश्यकताओं के अनुसार, न्यूनतम संस्कृति मीडिया में अन्य अड़ियल पदार्थों को जोड़कर, विभिन्न प्रदूषकों के लिए स्क्रीनिंग परीक्षणों को दर्जी करना संभव है।
Introduction
मिट्टी पृथ्वी पर जीवन का एक मौलिक घटक है और कई पारिस्थितिक तंत्रों का आधार है। मिट्टी में खनिजों, कार्बनिक पदार्थों और सूक्ष्मजीवों को एक प्रणाली के रूप में माना जा सकता है, उनके बीच होने वाले घनिष्ठ संबंधों और बातचीत के साथ। इन यौगिकों की बातचीत स्थलीय प्रक्रियाओं, पर्यावरण की गुणवत्ता और पारिस्थितिकी तंत्र के स्वास्थ्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभावडालती है। मृदा प्रदूषण दुनिया भर में गंभीर पर्यावरणीय समस्याएं पैदा करता है। कीटनाशकों, पेट्रोलियम उत्पादों, प्लास्टिक और अन्य रसायनों जैसे अड़ियल और विषाक्त पदार्थों के अंधाधुंध, दीर्घकालिक और अत्यधिक अनुप्रयोग का मिट्टी की पारिस्थितिकी पर गंभीर प्रभाव पड़ता है और परिणामस्वरूप, मिट्टी माइक्रोबायोटा को बदल सकता है। मिट्टी में माइक्रोबियल समुदाय विभिन्न शारीरिक राज्यों में जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला से बने होते हैं, जिनमें से अधिकांश बैक्टीरिया और कवक होते हैं। मिट्टी में कई संदूषकों में मध्यम से दीर्घकालिक स्थिरता होती है, और उनकी दृढ़ता अनुकूली तंत्र के विकास का कारण बन सकती है जो सूक्ष्मजीवों को पोषक तत्वों के रूप में अड़ियल पदार्थों का उपयोग करने की अनुमति देती है 2,3। इसलिए, इन सूक्ष्मजीवों को बायोरेमेडिएशन तकनीकों के लिए माना जा सकता है।
बायोरेमेडिएशन कम विषाक्त या गैर-विषैले यौगिकों में अपशिष्ट के क्षरण या परिवर्तन के लिए सूक्ष्मजीवों और उनके एंजाइमों का उपयोग करके प्रदूषण के प्रभावों को कम करने की कोशिश करता है। आर्किया, बैक्टीरिया, शैवाल और कवक की विभिन्न प्रजातियों में यह बायोरेमेडिएशन क्षमताहै। उनके विशेष बायोडिग्रेडेटिव कार्यों के परिणामस्वरूप, कवक विशेष रूप से बायोरेमेडिएशन के लिए होनहार जीव हैं। वे अपने हाइफ़ल नेटवर्क का उपयोग करके विभिन्न सब्सट्रेट्स पर हमला कर सकते हैं, जिससे उन्हें अन्य सूक्ष्मजीवों की तुलना में मिट्टी मैट्रिक्स को अधिक कुशलता से भेदने में सक्षम बनाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वे दुर्गम इंटरस्टिस तक पहुंच सकते हैं जहां संदूषकों को5 को हटाना मुश्किल है, और वे कम नमी के स्तर6 से भी बच सकते हैं। इसके अलावा, कवक अनिर्दिष्ट एंजाइमों के विभिन्न कैसेटों को संश्लेषित करते हैं, आमतौर पर सेल्यूलोज, लिग्निन और ह्यूमिक एसिड जैसे प्राकृतिक अड़ियल पदार्थों को नीचा दिखाने के लिए। जिन लोगों के पास लक्ष्य सब्सट्रेट की कमी है, वे हाइड्रोकार्बन, प्लास्टिक और कीटनाशकों 7,8,9,10 जैसे अड़ियल प्रदूषकों की एक विस्तृत श्रृंखला के क्षरण में शामिल हो सकते हैं। इसलिए, हालांकि कई कवक प्रजातियों को पहले से ही बायोरेमेडिएशन एजेंटों के रूप में रिपोर्ट किया गया है, लेकिन उन प्रजातियों की खोज में रुचि बढ़ रही है जो अभी तक अड़ियल दूषित पदार्थों के बायोरेमेडिएशन के लिए उम्मीदवारों का चयन करने के लिए अध्ययन नहीं किए गए हैं। जिन प्रजातियों को पहले से ही बायोरेमेडिएशन गुणों के लिए जाना जाता है, वे फाइला एस्कोमाइकोटा 11,12,13, बेसिडिओमाइकोटा 14,15 और म्यूकोरोमिकोटा से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, जेनेरा पेनिसिलियम और एस्परगिलस को एलिफैटिक हाइड्रोकार्बन 13, विभिन्न प्लास्टिक पॉलिमर16,17,18, भारी धातुओं 19, और रंजक20 के क्षरण में शामिल होने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। इसी तरह, बेसिडियोमाइसेट्स कवक पर किए गए अध्ययन, जैसे कि फेनेरोकोटेटे क्रिसोस्पोरियम और ट्रैमेट्स वर्सीकोलर, ने सुगंधित हाइड्रोकार्बन13 और प्लास्टिक21 जैसे अड़ियल पदार्थों के ऑक्सीकरण में उनकी भागीदारी का खुलासा किया है। बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं में शामिल कवक का एक और उदाहरण zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., और Cunninghamella spp.22,23 हैं। विशेष रूप से, कनिंघमेला सुगंधित हाइड्रोकार्बन को ऑक्सीडेज करने में सक्षम है और इसे ज़ेनोबायोटिक्स13 की एक विस्तृत श्रृंखला से उत्पादों के विषहरण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव माना जाता है।
वहाँ कई कवक एंजाइमों recalcitrant सामग्री24,25, जैसे esterase, laccase, पेरोक्सीडेज, और प्रोटीज के प्रमुख degradative प्रक्रियाओं में शामिल हैं। Laccases तांबे युक्त ऑक्सीडेज सेल में उत्पादित और बाद में स्रावित कर रहे हैं, कि phenolic और सुगंधित यौगिकों की एक किस्म के ऑक्सीकरण की अनुमति देते हैं. वे ऑर्थो और पैरा डाइफेनोल्स, अमीनो समूह-युक्त फिनोल, लिग्निन और ऐरिल समूह-युक्त डायमाइन्स26 को नीचा दिखा सकते हैं। पेरोक्सीडेस लिग्निन और अन्य सुगंधित यौगिकों को नीचा दिखाने के लिए मध्यस्थ के रूप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करते हैं। कई अलग-अलग पेरोक्सीडेस हैं, लेकिन विषाक्त पदार्थों को नीचा दिखाने की सबसे बड़ी क्षमता वाले लोग लिग्निन पेरोक्सीडेज और मैंगनीज पेरोक्सीडेज27 हैं।
एस्टेरेस और प्रोटीज अतिरिक्त या एक्टो-सेलुलर एंजाइमों के समूह से संबंधित हैं, जो अपने मूल कोशिकाओं के बाहर कार्य करते हैं लेकिन अभी भी उनके लिए बाध्य हैं। ये एंजाइम छोटे लोगों में बड़े अड़ियल अणुओं के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित कर सकते हैं। उनकी कम सब्सट्रेट विशिष्टता के कारण, ये एंजाइम विभिन्न प्रदूषकों के बायोरेमेडिएशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, जैसे कि कपड़ा रंजक, लुगदी और कागज उद्योगों से जारी बहिस्त्राव और चमड़े की कमाना, पेट्रोलियम उत्पाद, प्लास्टिक और कीटनाशक 28,29,30।
बायोरेमेडिएटिव फंगल उपभेदों के लिए चयन करने के लिए कई स्क्रीनिंग विधियों को पहले ही प्रकाशित किया जा चुका है। उदाहरण के लिए, पुआल-आधारित अगर माध्यम का उपयोग पॉलीसाइक्लिक एरोमैटिक हाइड्रोकार्बन (पीएएच) गिरावट31 में उच्च क्षमता के साथ सफेद-सड़ांध कवक के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया है; और सड़ने वाली लकड़ी के छोटे टुकड़ों को माल्ट निकालने आगर (एमईए) पर रखा गया है ताकि लकड़ी-सड़ने वाले कवक32 को अलग किया जा सके। हालांकि, पहले से ही प्रस्तावित किए गए अधिकांश तरीके रुचि की अपनी गतिविधि के लिए बहुत विशिष्ट कवक का चयन करते हैं। यह शोध कार्रवाई की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ मिट्टी कवक का चयन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण का प्रस्ताव करता है। विधि ह्यूमिक एसिड या लिग्नोसेल्यूलोज के साथ संशोधित एक माध्यम पर मिट्टी के नमूनों के सीरियल dilutions के प्रारंभिक चढ़ाना पर निर्भर करता है जो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिश्रित होता है ताकि इन प्राकृतिक अड़ियल पदार्थों को नीचा दिखाने की क्षमता के साथ कवक का चयन किया जा सके। ह्यूमिक एसिड और लिग्नोसेल्युलोज, वास्तव में, ऐसे पदार्थ हैं जो बायोडिग्रेडेशन के लिए बेहद प्रतिरोधी हैं क्योंकि उनके पास बहुत जटिल आणविक संरचनाएं हैं, और यह उन्हें परीक्षण किए गए कवक33,34 की डिग्रेडेटिव क्षमता के उत्कृष्ट संकेतक होने की अनुमति देता है। इसके बाद, पहले परीक्षणों में चुने गए कवक को उन लोगों की पहचान करने के लिए जांच की जाती है, जिनके पास पेट्रोलेटम, उपयोग किए गए इंजन तेल और प्लास्टिक जैसे विशिष्ट प्रदूषकों को नीचा दिखाने की क्षमता होती है। अंत में, गुणात्मक एंजाइमेटिक परीक्षण कवक उपभेदों का पता लगाने के लिए किए जाते हैं जो अड़ियल पदार्थों की बायोडिग्रेडेशन प्रक्रियाओं में शामिल एंजाइमों का उत्पादन करने में सक्षम होते हैं। इस उद्देश्य के लिए, प्रोटीज और एस्टेरेस परीक्षण आयोजित किए जाते हैं, जबकि गैलिक एसिड और गुआकोल का उपयोग लैक्केस और अन्य लिग्निनोलिटिक एंजाइम उत्पादन35,36 के संकेतकों के रूप में किया जाता है। इन सब्सट्रेट्स का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि कवक की क्षमता के बीच एक मजबूत सहसंबंध पाया गया है ताकि उन्हें अपने भूरे रंग के रूप में ऑक्सीकरण किया जा सके और लिग्निनोलिटिक क्षमता 37,38,39 के कब्जे के बीच।
इन प्रोटोकॉल के माध्यम से, उच्च अवक्रमक क्षमता और मिट्टी के नमूनों से सीधे कार्रवाई के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ कवक उपभेदों को अलग करना संभव है। इन कवक उपभेदों का अलगाव बायोरेमेडिएशन उद्देश्यों के लिए नए उम्मीदवारों को खोजने में मदद कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मिट्टी की समृद्ध जैव विविधता कवक का एक प्रचुर स्रोत है जिसमें कई चयापचय क्षमताएं हैं, जिनमें से कुछ बायोरेमेडिएशन के लिए संभावित उम्मीदवार हो सकते हैं। चयनात्मक मीडिया परीक्षण (प्रोटोकॉल की धारा 1) अप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस काम के लिए अवसर प्रदान करने के लिए पाविया विश्वविद्यालय के Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) और प्रोफेसर Solveig Tosi को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 96 microwell plate | Greiner bio-one | 650185 | |
| Agar | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas Broth | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Chloroamphenicol | Eurobio | GABCRL006Z | |
| Chlortetracycline | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| gallic acid | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| Glass cover slips | Biosigma | VBS634 | |
| Glass vials 15 mL | SciLabware | P35467 | |
| guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| High-density polyethylene (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| Humic acids | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Lignocellulose | / | / | Sterilized bioethanol production waste |
| L-shaped cell spreader | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| magnetic stirrer | A.C.E.F | 8235 | |
| Malt Extract Broth | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Micropipette 1000 μL | Gilson | FA10006M | |
| Micropipette 200 μL | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neomycin | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| peptone | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| Petri dishes | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| Petrolatum (Paraffin liquid) | A.C.E.F | 009661 | |
| Potato Dextrose Broth | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| Polystyrene (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| Polyurethane (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| Sterile falcon tube | Greiner bio-one | 227 261 | |
| Sterile glass vials 20 mL | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| Sterile point 1000 μL | Gilson | F172511 | |
| Sterile point 200 μL | Gilson | F172311 | |
| Sterile polyethylene bags | WHIRL-PAK | B01018 | |
| sterile syringe | Rays | 5523CM25 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Used engine oil | / | / | complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company |
| Vials 50 mL | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
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