반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science,Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute
Summary
본 프로토콜은 재사용 가능한 단일 세포를 사용하여 반복적인 후성유전체 분석을 위한 단일 세포 방법을 설명합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하고 결과를 통계적으로 검증할 수 있습니다.
Abstract
현재의 단일 세포 에피게놈 분석은 일회용으로 설계되었습니다. 세포는 일회성 사용 후 폐기되어 단일 세포에서 여러 후성유전학적 표지를 분석할 수 없으며 단일 세포에서 실험 배경 잡음과 신호를 구별하기 위해 다른 세포의 데이터가 필요합니다. 이 논문은 반복적인 후성유전체학 분석을 위해 동일한 단일 세포를 재사용하는 방법을 설명합니다.
이 실험 방법에서 세포 단백질은 단백질과 DNA에 가교하는 대신 먼저 폴리아크릴아미드 폴리머에 고정되어 구조적 편향을 완화합니다. 이 중요한 단계를 통해 동일한 단일 세포로 반복적인 실험이 가능합니다. 다음으로, 근접 결찰을 위한 스캐폴드 서열을 가진 무작위 프라이머를 게놈 DNA에 어닐링하고, DNA 중합효소를 이용하여 연장하여 프라이머에 게놈 서열을 첨가한다. 이어서, 후성유전학적 마커 및 대조군 IgG에 대한 항체는 각각 상이한 DNA 프로브로 표지되어 동일한 단일 세포 내의 각각의 표적에 결합된다.
근접 라이게이션은 랜덤 프라이머와 항체-DNA 프로브의 스캐폴드 서열에 상보적인 서열을 가진 커넥터 DNA를 부가함으로써 랜덤 프라이머와 항체 사이에 유도된다. 이 접근법은 항체 정보와 주변 게놈 서열을 근접 결찰의 단일 DNA 산물에 통합합니다. 이 방법을 사용하면 동일한 단일 세포로 반복 실험을 수행할 수 있으므로 희귀 세포의 데이터 밀도를 높이고 동일한 세포의 IgG 및 항체 데이터만 사용하여 통계 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로 제조된 재사용 가능한 단일 세포는 최소 몇 개월 동안 보관하고 나중에 재사용하여 후성유전학적 특성을 넓히고 데이터 밀도를 높일 수 있습니다. 이 방법은 연구자와 프로젝트에 유연성을 제공합니다.
Introduction
Single-cell 기술은 개별 single-cell omics 기술을 통합하는 single-cell multiomics의 시대로 진입하고 있습니다1. 최근 단일 세포 전사체학은 염색질 접근성(scNMT-seq2 및 SHARE-seq3) 또는 히스톤 변형(Paired-seq4 및 Paired-Tag5)을 검출하는 방법과 결합되었습니다. 보다 최근에는 단일 세포 전사체학 및 단백질체학이 염색질 접근성과 통합되었습니다(DOGMA-seq6). 이러한 방법은 염색질 접근성 또는 히스톤 변형을 감지하기 위해 전이효소 기반 태깅을 사용합니다.
전이효소 기반 접근 방식은 게놈 DNA를 절단하고 게놈 DNA 단편 끝에 DNA 바코드를 추가합니다. 절단된 각 게놈 단편은 최대 2개의 DNA 바코드(= 절단 부위당 하나의 후성유전학적 마크)만 수용할 수 있으며 절단 부위의 게놈 DNA는 손실됩니다. 따라서 분열 기반 접근법은 테스트된 후성유전학적 마크의 수와 신호 밀도 사이에 절충안이 있습니다. 이것은 동일한 단일 세포에서 여러 후성 유전 학적 표지의 분석을 방해합니다. 게놈 DNA를 절단하지 않는 단세포 후성유전체법이 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다 7,8.
위에서 언급한 절단 유래 문제 외에도 전이효소 기반 접근 방식에는 다른 제한 사항이 있습니다. 단일 세포 후성유전체 분석에서는 게놈에서 히스톤과 DNA 관련 단백질의 위치를 아는 것이 중요합니다. 현재의 접근법에서, 이것은 고정되지 않은 단일 세포와 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용의 유지를 사용함으로써 달성된다. 그러나 이것은 히스톤 변형 분석에서도 접근 가능한 염색질 영역에 강한 편향을 일으킨다9. 게놈 상의 히스톤 및 게놈 관련 단백질의 위치는 폴리아크릴아미드 스캐폴드 7,8을 사용하여 단백질-DNA 및 단백질-단백질을 가교하지 않고 보존할 수 있습니다. 이 접근법은 단백질-DNA 및 단백질-단백질 상호작용에 의존하는 현재 접근법에서 관찰되는 구조적 편향을 줄입니다.
전이효소 기반 접근법은 단일 세포에서 신호를 한 번만 획득할 수 있습니다. 따라서 신호의 감소로 인해 단일 세포의 완전한 후성유전체를 묘사하는 것은 어렵습니다. 재사용 가능한 단일 세포는 동일한 단일 세포에서 반복적인 후성유전체 분석을 허용함으로써 현재의 한계를 극복하기 위해 개발되었습니다.
Protocol
참고: 이 방법의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 그림 1: 프로토콜 워크플로의 개략도. 7.2-13단계는 개략도를 통해 설명됩니다. 각 행은 프로토콜의 단계를 나타냅니다. 녹색으로 착색된 세포 단백질은 결정 구조(PDB: 6M4G)를 기?…
Representative Results
K562 단일 세포는 단계 8에 기술된 프로토콜을 사용하여 생성되었다( 도 5 참조). 단일세포는 폴리아크릴아미드 비드의 외층에 포매되었다. 세포 DNA를 염색하고 DNA 염색을 위해 인터칼레이터 염료를 사용하여 시각화했습니다. 그림 5: 생성…
Discussion
이 글은 재사용 가능한 단일세포를 이용한 최근 보고된 single-cell multiepigenomic 분석에 대한 단계별 프로토콜을 설명한다7. 다음 단락에서는 프로토콜의 잠재적 한계를 강조하면서 중요한 사항에 대해 논의합니다.
프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 점 중 하나 (7.2-13 단계에서)는 DNase 오염을 피하는 것입니다. 단일 세포에는 게놈 DNA 사본이 두 개뿐입니다. 따라서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
프로젝트의 개념화 단계에서 의견을 주신 David Sanchez-Martin 박사와 Christopher B. Buck 박사에게 감사드립니다. 또한 예비 실험에 도움을 주신 Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 그리고 전산 분석에 대한 조언을 해주신 Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH에 감사드립니다. 이 방법에 사용되는 DNA 중합효소의 최적화를 도와준 Ms. Anna Word에게 감사드립니다. 이 작업은 NIHHPC Biowulf 클러스터(http://hpc.nih.gov)의 계산 리소스를 활용했습니다. 이 프로젝트는 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 국립 보건원의 교내 프로그램, NCI 이사 혁신상(#397172) 및 계약 번호 HHSN261200800001E에 따라 국립 암 연구소의 연방 기금의 지원을 받습니다. 생산적인 의견을 주신 Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy 및 Laboratory of Cellular Oncology의 모든 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).