خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتحليلات الجينومية التكرارية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة الخلية الواحدة للتحليلات فوق الجينية التكرارية باستخدام خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام. تسمح الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام بتحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية المفردة والتحقق الإحصائي من النتائج.
Abstract
تم تصميم تحليلات epigenome أحادية الخلية الحالية للاستخدام مرة واحدة. يتم التخلص من الخلية بعد استخدام واحد ، مما يمنع تحليل العلامات اللاجينية المتعددة في خلية واحدة ويتطلب بيانات من خلايا أخرى لتمييز الإشارة عن ضوضاء الخلفية التجريبية في خلية واحدة. تصف هذه الورقة طريقة لإعادة استخدام نفس الخلية المفردة للتحليلات فوق الجينية التكرارية.
في هذه الطريقة التجريبية ، يتم تثبيت البروتينات الخلوية أولا على بوليمر بولي أكريلاميد بدلا من ربطها بالبروتين والحمض النووي ، مما يخفف من التحيز الهيكلي. تسمح هذه الخطوة الحاسمة بإجراء تجارب متكررة مع نفس الخلية المفردة. بعد ذلك ، يتم تلدين التمهيدي العشوائي مع تسلسل سقالة لربط القرب إلى الحمض النووي الجينومي ، ويتم إضافة التسلسل الجينومي إلى التمهيدي بالامتداد باستخدام بوليميراز الحمض النووي. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد ضد علامة جينية وتحكم IgG ، كل منها يحمل تحقيقات مختلفة للحمض النووي ، بالأهداف المعنية في نفس الخلية الواحدة.
يتم تحفيز ربط القرب بين التمهيدي العشوائي والجسم المضاد عن طريق إضافة الحمض النووي الموصل مع تسلسلات تكميلية إلى تسلسل سقالة التمهيدي العشوائي ومسبار الحمض النووي للجسم المضاد. يدمج هذا النهج معلومات الأجسام المضادة وتسلسل الجينوم القريب في منتج DNA واحد لربط القرب. من خلال تمكين التجارب المتكررة مع نفس الخلية المفردة ، تسمح هذه الطريقة بزيادة كثافة البيانات من خلية نادرة والتحليل الإحصائي باستخدام بيانات IgG والأجسام المضادة فقط من نفس الخلية. يمكن تخزين الخلايا المفردة القابلة لإعادة الاستخدام المحضرة بهذه الطريقة لبضعة أشهر على الأقل وإعادة استخدامها لاحقا لتوسيع التوصيف اللاجيني وزيادة كثافة البيانات. توفر هذه الطريقة المرونة للباحثين ومشاريعهم.
Introduction
تدخل تقنية الخلية الواحدة عصر تعدد الخلايا المفردة ، والذي يدمج تقنيات omics الفردية أحادية الخلية1. في الآونة الأخيرة ، تم دمج النسخ أحادي الخلية مع طرق للكشف عن إمكانية الوصول إلى الكروماتين (scNMT-seq2 و SHARE-seq3) أو تعديلات هيستون (Paired-seq4 و Paired-Tag5). في الآونة الأخيرة ، تم دمج النسخ أحادي الخلية والبروتينات مع إمكانية الوصول إلى الكروماتين (DOGMA-seq6). تستخدم هذه الطرق العلامات المستندة إلى transposase للكشف عن إمكانية الوصول إلى الكروماتين أو تعديلات الهستون.
تشق الأساليب القائمة على Transposase الحمض النووي الجينومي وتضيف رمزا شريطيا للحمض النووي في نهاية جزء الحمض النووي الجينومي. يمكن لكل جزء جينومي مشقوق قبول ما يصل إلى رمزين شريطيين للحمض النووي (= علامة جينية واحدة لكل موقع انقسام) ، ويتم فقد الحمض النووي الجينومي في موقع الانقسام. لذلك ، فإن النهج القائمة على الانقسام لها مفاضلة بين عدد العلامات اللاجينية التي تم اختبارها وكثافة الإشارة. هذا يعيق تحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية الواحدة. تم تطوير طريقة فوق جينومية أحادية الخلية لا تشق الحمض النووي الجينومي للتغلب على هذه المشكلة 7,8.
بالإضافة إلى القضية المشتقة من الانقسام المذكورة أعلاه ، فإن النهج القائمة على الترانسبوزاز لها قيود أخرى. في تحليل epigenome أحادي الخلية ، من الأهمية بمكان معرفة موقع الهستونات والبروتينات المرتبطة بالحمض النووي على الجينوم. في الأساليب الحالية ، يتم تحقيق ذلك باستخدام خلايا مفردة غير ثابتة والاحتفاظ بتفاعلات البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين. ومع ذلك ، فإن هذا يولد تحيزا قويا لمناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ، حتى في تحليل تعديلات الهستون 9. يمكن الحفاظ على موقع الهستونات والبروتينات المرتبطة بالجينوم على الجينوم دون ربط البروتين – الحمض النووي والبروتين – البروتين ، باستخدام سقالة بولي أكريلاميد 7,8. يقلل هذا النهج من التحيز الهيكلي الملاحظ في الأساليب الحالية التي تعتمد على تفاعلات البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين.
يمكن للنهج القائمة على Transposase الحصول على إشارات مرة واحدة فقط من خلية واحدة. لذلك ، من الصعب تحديد epigenome الكامل لخلية واحدة بسبب انخفاض الإشارات. تم تطوير خلايا مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتغلب على القيود الحالية من خلال السماح بالتحليل الجيني التكراري في نفس الخلية المفردة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة البروتوكول خطوة بخطوة للتحليل متعدد الخلايا أحادية الخلية الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرا باستخدام خلايا مفردة قابلة لإعادة الاستخدام7. في الفقرات اللاحقة ، نناقش النقاط الحرجة ، مع التركيز على القيود المحتملة في البروتوكول.
إحدى النقاط الحرجة في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ديفيد سانشيز مارتن وكريستوفر ب. باك على تعليقاتهما خلال مرحلة وضع المفاهيم للمشروع. كما نشكر مركز الجينوم ، ومركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة للمساعدة في التجارب الأولية ، وموارد المعلوماتية الحيوية التعاونية ، و CCR ، و NCI ، و NIH للحصول على المشورة في التحليل الحسابي. نشكر السيدة آنا وورد على المساعدة في تحسين بوليميراز الحمض النووي المستخدم في الطريقة. استخدم هذا العمل الموارد الحسابية لمجموعة NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). يتم دعم هذا المشروع من قبل البرنامج الداخلي لمركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة ، وجائزة الابتكار لمدير المعهد الوطني للسرطان (# 397172) ، والأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للسرطان بموجب العقد رقم HHSN261200800001E. نشكر الدكاترة توم ميستيلي وكارول ثيل ودوغلاس آر لوي وجميع أعضاء مختبر الأورام الخلوية على تعليقاتهم المثمرة.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
- Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
- Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
- Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
- Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
- Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
- Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
- Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
- Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
