תא בודד לשימוש חוזר לניתוחים אפיגנומיים איטרטיביים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חד-תאית לאנליזות אפיגנומיות איטרטיביות באמצעות תא בודד לשימוש חוזר. התא הבודד הניתן לשימוש חוזר מאפשר ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד ותיקוף סטטיסטי של התוצאות.
Abstract
ניתוחי אפיגנום חד-תאיים נוכחיים מיועדים לשימוש חד-פעמי. התא מושלך לאחר שימוש יחיד, מה שמונע ניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים בתא בודד ודורש נתונים מתאים אחרים כדי להבחין בין אות לרעשי רקע ניסיוניים בתא בודד. מאמר זה מתאר שיטה לשימוש חוזר באותו תא בודד לצורך אנליזות אפיגנומיות איטרטיביות.
בשיטה ניסיונית זו, חלבונים תאיים מעוגנים תחילה לפולימר פוליאקרילאמיד במקום להצליב אותם לחלבון ולדנ”א, ובכך להקל על הטיה מבנית. שלב קריטי זה מאפשר ניסויים חוזרים ונשנים עם אותו תא בודד. לאחר מכן, פריימר אקראי עם רצף פיגום לקשירת קרבה מחושל לדנ”א הגנומי, והרצף הגנומי מתווסף לפריימר על ידי הרחבה באמצעות DNA פולימראז. לאחר מכן, נוגדן כנגד סמן אפיגנטי ובקרת IgG, שכל אחד מהם מסומן בבדיקות DNA שונות, קשורים למטרות בהתאמה באותו תא בודד.
קשירת קרבה נוצרת בין הפריימר האקראי לבין הנוגדן על ידי הוספת DNA מחבר עם רצפים משלימים לרצף הפיגום של הפריימר האקראי ובדיקת הנוגדן-DNA. גישה זו משלבת מידע נוגדנים ורצפי גנום סמוכים בתוצר DNA יחיד של קשירת קרבה. על ידי הפעלת ניסויים חוזרים עם אותו תא בודד, שיטה זו מאפשרת עלייה בצפיפות הנתונים מתא נדיר וניתוח סטטיסטי באמצעות נתוני IgG ונוגדנים בלבד מאותו תא. התאים הבודדים לשימוש חוזר שהוכנו בשיטה זו יכולים להיות מאוחסנים לפחות מספר חודשים ונעשה בהם שימוש חוזר מאוחר יותר כדי להרחיב את האפיון האפיגנטי ולהגדיל את צפיפות הנתונים. שיטה זו מספקת גמישות לחוקרים ולפרויקטים שלהם.
Introduction
טכנולוגיית התא הבודד נכנסת לעידן המולטיומיקס החד-תאי, המשלב טכנולוגיות אומיקס בודדות של תא בודד1. לאחרונה, תעתיק תא בודד שולב עם שיטות לזיהוי נגישות כרומטין (scNMT-seq2 ו- SHARE-seq3) או שינויים בהיסטון (Paired-seq4 ו- Paired-Tag5). לאחרונה, שעתוק חד-תאי ופרוטאומיקה שולבו עם נגישות הכרומטין (DOGMA-seq6). שיטות אלה משתמשות בתיוג מבוסס טרנספוזאז לאיתור נגישות כרומטין או שינויים בהיסטון.
גישות מבוססות טרנספוזאז קוטעות את הדנ”א הגנומי ומוסיפות ברקוד DNA בקצה מקטע הדנ”א הגנומי. כל מקטע גנומי שסוע יכול לקבל רק עד שני ברקודים של דנ”א (= סימן אפיגנטי אחד לכל אתר מחשוף), והדנ”א הגנומי באתר המחשוף אובד. לכן, לגישות מבוססות מחשוף יש פשרה בין מספר הסימנים האפיגנטיים שנבדקו לבין צפיפות האות. זה מעכב את הניתוח של סימנים אפיגנטיים מרובים באותו תא בודד. שיטה אפיגנומית חד-תאית שאינה מנתקת את הדנ”א הגנומי פותחה כדי להתגבר על בעיה זו 7,8.
בנוסף לנושא שמקורו במחשוף שהוזכר לעיל, לגישות מבוססות טרנספוזאז יש מגבלות נוספות. בניתוח אפיגנום של תא יחיד, חיוני לדעת את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לדנ”א על הגנום. בגישות הנוכחיות, זה מושג על ידי שימוש בתאים בודדים לא קבועים ושימור אינטראקציות חלבון-דנ”א וחלבון-חלבון. עם זאת, זה יוצר הטיה חזקה לאזורי כרומטין נגישים, אפילו בניתוח של שינויים היסטון 9. ניתן לשמר את מיקומם של היסטונים וחלבונים הקשורים לגנום על הגנום ללא קישור בין חלבון-דנ”א לחלבון-חלבון, באמצעות פיגום פוליאקרילאמיד 7,8. גישה זו מפחיתה את ההטיה המבנית שנצפתה בגישות הנוכחיות התלויות באינטראקציות חלבון-דנ”א וחלבון-חלבון.
גישות מבוססות טרנספוזאז יכולות לקבל אותות רק פעם אחת מתא יחיד. לכן, קשה להגדיר את האפיגנום המלא של תא בודד עקב ירידת האותות. תאים בודדים לשימוש חוזר פותחו כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות על ידי מתן אפשרות לניתוח אפיגנומי איטרטיבי באותו תא בודד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב עבור ניתוח רב-אפיגנומי של תא בודד שדווח לאחרונה באמצעות תאים בודדים לשימוש חוזר7. בפסקאות הבאות נדון בנקודות קריטיות, תוך הדגשת מגבלות אפשריות בפרוטוקול.
אחת הנקודות הקריטיות לאורך הפרוטוקול (משלבים 7.2-13) היא הימנעות מזיהום…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר דיוויד סאנצ’ז-מרטין וד”ר כריסטופר באק על ההערות בשלב ההמשגה של הפרויקט. אנו מודים גם ל-Genomics Core, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות על העזרה בניסויים מקדימים, והמשאב הביואינפורמטי השיתופי, CCR, NCI, NIH על הייעוץ בניתוח חישובי. אנו מודים לגב’ אנה וורד על עזרתה באופטימיזציה של DNA פולימראז המשמש בשיטה. עבודה זו השתמשה במשאבים החישוביים של אשכול NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). פרויקט זה נתמך על ידי תוכנית Intramural של המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, פרס החדשנות של מנהל NCI (#397172), וקרנות פדרליות מהמכון הלאומי לסרטן תחת חוזה מס ‘HHSN261200800001E. אנו מודים לד”ר טום מיסטלי, קרול תיל, דאגלס ר. לואי ולכל חברי המעבדה לאונקולוגיה תאית על הערות פרודוקטיביות.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
- Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
- Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
- Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
- Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
- Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
- Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
- Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
- Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
