反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science,Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute
Summary
本プロトコルは、再利用可能な単一細胞を用いた反復エピゲノム解析のための単一細胞法を記載する。再利用可能なシングルセルにより、同じシングルセル内の複数のエピジェネティックマークの分析と結果の統計的検証が可能になります。
Abstract
現在のシングルセルエピゲノム解析は、シングルユース向けに設計されています。細胞は1回の使用で廃棄されるため、単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析が妨げられ、単一細胞内の実験的バックグラウンドノイズからシグナルを区別するために他の細胞からのデータが必要になります。この論文では、反復的なエピゲノム解析のために同じ単一細胞を再利用する方法について説明します。
この実験方法では、細胞タンパク質をタンパク質やDNAに架橋するのではなく、まずポリアクリルアミドポリマーに固定し、構造バイアスを軽減します。この重要なステップにより、同じ単一細胞で繰り返し実験を行うことができます。次に、近接ライゲーション用のスキャフォールド配列を有するランダムプライマーをゲノムDNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼを用いて伸長によりゲノム配列をプライマーに付加する。続いて、それぞれ異なるDNAプローブで標識されたエピジェネティックマーカーおよびコントロールIgGに対する抗体を、同じ単一細胞内のそれぞれの標的に結合させる。
ランダムプライマーと抗体-DNAプローブの足場配列に相補配列を有するコネクターDNAを付加することにより、ランダムプライマーと抗体との間の近接ライゲーションが誘導される。このアプローチは、抗体情報と近くのゲノム配列を近接ライゲーションの単一のDNA産物に統合します。同じ単一細胞で実験を繰り返すことで、希少細胞からのデータ密度を高め、同一細胞のIgGと抗体データのみを用いた統計解析を可能にします。この方法で調製された再利用可能な単一細胞は、少なくとも数ヶ月間保存し、後で再利用してエピジェネティックな特性評価を広げ、データ密度を高めることができます。この方法は、研究者とそのプロジェクトに柔軟性を提供します。
Introduction
シングルセル技術は、個々のシングルセルオミクス技術を統合したシングルセルマルチオミクスの時代に突入しています1。最近、シングルセルトランスクリプトミクスは、クロマチンアクセシビリティ(scNMT-seq2 およびSHARE-seq 3)またはヒストン修飾(ペア-seq4 およびペアタグ5)を検出するための方法と組み合わせています。最近では、シングルセルトランスクリプトミクスとプロテオミクスがクロマチンアクセシビリティと統合されました(DOGMA-seq6)。これらの方法は、クロマチンアクセシビリティまたはヒストン修飾を検出するためにトランスポザーゼベースのタグ付けを使用します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNA断片の最後にDNAバーコードを追加します。切断された各ゲノム断片は、最大2つのDNAバーコード(=切断部位ごとに1つのエピジェネティックマーク)しか受け入れることができず、切断部位のゲノムDNAは失われます。したがって、切断ベースのアプローチは、テストされるエピジェネティックマークの数とシグナル密度の間にトレードオフがあります。これは、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析を妨げます。この問題を克服するために、ゲノムDNAを切断しない単一細胞エピゲノム法が開発されました7,8。
上記の切断由来の問題に加えて、トランスポザーゼベースのアプローチには他の制限があります。シングルセルエピゲノム解析では、ゲノム上のヒストンやDNA関連タンパク質の位置を知ることが重要です。現在のアプローチでは、これは未固定の単一細胞を使用し、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用を保持することによって達成されます。しかし、これは、ヒストン修飾の分析においても、アクセス可能なクロマチン領域に強いバイアスを発生させる9。ゲノム上のヒストンおよびゲノム関連タンパク質の位置は、ポリアクリルアミド足場を使用して、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質を架橋することなく保存することができる7,8。このアプローチは、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用に依存する現在のアプローチで観察される構造バイアスを低減します。
トランスポザーゼベースのアプローチは、単一の細胞から一度だけシグナルを取得できます。したがって、シグナルのドロップオフのために単一細胞の完全なエピゲノムを描写することは困難である。再利用可能な単一細胞は、同じ単一細胞内で反復的なエピゲノム解析を可能にすることにより、現在の制限を克服するために開発されました。
Protocol
メモ: この方法の概略図を 図 1 に示します。 図1:プロトコルワークフローの概略図。ステップ7.2〜13は、概略図を使用して説明されています。各行は、プロトコルのステップを示します。緑色に着色された細胞タンパク質は?…
Representative Results
K562単一細胞は、ステップ8に記載されるプロトコルを用いて生成された( 図5参照)。単一細胞は、ポリアクリルアミドビーズの外層に包埋した。細胞DNAを染色し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。 図5:生成され…
Discussion
この記事では、再利用可能な単一細胞7を使用した最近報告された単一細胞マルチエピゲノム解析の段階的なプロトコルについて説明します。後続の段落では、プロトコルの潜在的な制限を強調して、重要なポイントについて説明します。
プロトコル全体(ステップ7.2〜13から)の重要なポイントの1つは、DNase汚染を回避することです。1つの細胞にはゲノ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロジェクトの概念化段階でコメントをくださったDavid Sanchez-Martin博士とChristopher B. Buck博士に感謝します。また、予備実験の支援を提供してくれたGenomics Core、Center for Cancer Research、National Cancer Institute、National Institutes of Health、および計算分析のアドバイスを提供してくれたCollaborative Bioinformatics Resource、CCR、NCI、NIHにも感謝します。この方法で使用されるDNAポリメラーゼの最適化を支援してくれたAnna Word氏に感謝します。この研究では、NIHHPCバイオウルフクラスター(http://hpc.nih.gov)の計算リソースを利用しました。このプロジェクトは、がん研究センター、国立がん研究所、国立衛生研究所、NCIディレクターズイノベーションアワード(#397172)、および契約番号HHSN261200800001Eに基づく国立がん研究所からの連邦資金によってサポートされています。Tom Misteli Drs、Carol Thiele、Douglas R. Lowy、および細胞腫瘍学研究所のすべてのメンバーに、生産的なコメントをいただき、感謝します。
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).