Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative utilizzando una singola cellula riutilizzabile. La singola cellula riutilizzabile consente l’analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula e la convalida statistica dei risultati.
Abstract
Le attuali analisi dell’epigenoma monocellulare sono progettate per l’uso singolo. La cellula viene scartata dopo un singolo utilizzo, impedendo l’analisi di più segni epigenetici in una singola cellula e richiedendo dati da altre cellule per distinguere il segnale dal rumore di fondo sperimentale in una singola cellula. Questo articolo descrive un metodo per riutilizzare la stessa singola cellula per analisi epigenomiche iterative.
In questo metodo sperimentale, le proteine cellulari vengono prima ancorate a un polimero di poliacrilammide invece di reticolarle a proteine e DNA, alleviando i pregiudizi strutturali. Questo passaggio critico consente esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula. Successivamente, un primer casuale con una sequenza di scaffold per la legatura di prossimità viene ricotto al DNA genomico e la sequenza genomica viene aggiunta al primer per estensione utilizzando una DNA polimerasi. Successivamente, un anticorpo contro un marcatore epigenetico e IgG di controllo, ciascuno marcato con diverse sonde di DNA, sono legati ai rispettivi bersagli nella stessa singola cellula.
La legatura di prossimità viene indotta tra il primer casuale e l’anticorpo aggiungendo un DNA connettore con sequenze complementari alla sequenza di scaffold del primer casuale e della sonda anticorpo-DNA. Questo approccio integra le informazioni sugli anticorpi e le sequenze del genoma vicino in un singolo prodotto del DNA di legatura di prossimità. Consentendo esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula, questo metodo consente un aumento della densità dei dati da una cellula rara e analisi statistiche utilizzando solo IgG e dati anticorpali dalla stessa cellula. Le singole cellule riutilizzabili preparate con questo metodo possono essere conservate per almeno alcuni mesi e riutilizzate in seguito per ampliare la caratterizzazione epigenetica e aumentare la densità dei dati. Questo metodo offre flessibilità ai ricercatori e ai loro progetti.
Introduction
La tecnologia a cella singola sta entrando nell’era della multiomica a cella singola, che integra le tecnologie omiche a singola cella individuale1. Recentemente, la trascrittomica a singola cellula è stata combinata con metodi per rilevare l’accessibilità della cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) o le modifiche istoniche (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Più recentemente, la trascrittomica e la proteomica a singola cellula sono state integrate con l’accessibilità della cromatina (DOGMA-seq6). Questi metodi utilizzano la marcatura basata sulla trasposasi per rilevare l’accessibilità della cromatina o le modifiche degli istoni.
Gli approcci basati sulla trasposasi scindono il DNA genomico e aggiungono un codice a barre del DNA alla fine del frammento di DNA genomico. Ogni frammento genomico scisso può accettare solo fino a due codici a barre del DNA (= un segno epigenetico per sito di scissione) e il DNA genomico nel sito di scissione viene perso. Pertanto, gli approcci basati sulla scissione hanno un compromesso tra il numero di segni epigenetici testati e la densità del segnale. Ciò ostacola l’analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula. Un metodo epigenomico unicellulare che non fende il DNA genomico è stato sviluppato per superare questo problema 7,8.
Oltre al problema derivato dalla scissione sopra menzionato, gli approcci basati sulla trasposasi hanno altre limitazioni. Nell’analisi dell’epigenoma a singola cellula, è fondamentale conoscere la posizione degli istoni e delle proteine associate al DNA sul genoma. Negli approcci attuali, questo si ottiene utilizzando singole cellule non fissate e la conservazione delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Tuttavia, ciò genera una forte distorsione verso le regioni della cromatina accessibili, anche nell’analisi delle modificazioni istoniche 9. La posizione degli istoni e delle proteine associate al genoma sul genoma può essere preservata senza reticolare proteina-DNA e proteina-proteina, utilizzando un’impalcatura di poliacrilammide 7,8. Questo approccio riduce la distorsione strutturale osservata negli approcci attuali che dipendono dalle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina.
Gli approcci basati sulla trasposasi possono acquisire segnali solo una volta da una singola cellula. Pertanto, è difficile delineare l’epigenoma completo di una singola cellula a causa della caduta dei segnali. Le singole cellule riutilizzabili sono state sviluppate per superare i limiti attuali consentendo l’analisi epigenomica iterativa nella stessa singola cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive il protocollo passo-passo per l’analisi multiepigenomica a singola cellula recentemente riportata utilizzando singole cellule riutilizzabili7. Nei paragrafi successivi, discutiamo i punti critici, sottolineando i potenziali limiti nel protocollo.
Uno dei punti critici in tutto il protocollo (dai passaggi 7.2-13) è evitare la contaminazione da DNasi. Una singola cellula ha solo due copie di DNA genomico. Pertanto, danneggiare il DNA genomico ri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i dottori David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck per i commenti durante la fase di concettualizzazione del progetto. Ringraziamo anche il Genomics Core, il Center for Cancer Research, il National Cancer Institute, il National Institutes of Health per l’aiuto negli esperimenti preliminari e la Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH per i consigli nell’analisi computazionale. Ringraziamo la signora Anna Word per l’aiuto nell’ottimizzazione delle DNA polimerasi utilizzate nel metodo. Questo lavoro ha utilizzato le risorse computazionali del cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Questo progetto è supportato dal programma intramurale del Center for Cancer Research, dal National Cancer Institute, dal National Institutes of Health, dal NCI Director’s Innovation Award (# 397172) e dai fondi federali del National Cancer Institute con contratto n. HHSN261200800001E. Ringraziamo i dottori Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e tutti i membri del Laboratorio di Oncologia Cellulare per i commenti produttivi.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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