Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses
Summary
Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.
Abstract
De huidige eencellige epigenoomanalyses zijn ontworpen voor eenmalig gebruik. De cel wordt na eenmalig gebruik weggegooid, waardoor analyse van meerdere epigenetische markeringen in een enkele cel wordt voorkomen en gegevens van andere cellen nodig zijn om signaal van experimentele achtergrondruis in een enkele cel te onderscheiden. Dit artikel beschrijft een methode om dezelfde enkele cel te hergebruiken voor iteratieve epigenomische analyses.
Bij deze experimentele methode worden cellulaire eiwitten eerst verankerd aan een polyacrylamidepolymeer in plaats van ze te koppelen aan eiwit en DNA, waardoor structurele vertekening wordt verlicht. Deze kritische stap maakt herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk. Vervolgens wordt een willekeurige primer met een steigersequentie voor nabijheidsligatie gegloeid aan het genomische DNA en wordt de genomische sequentie bij uitbreiding aan de primer toegevoegd met behulp van een DNA-polymerase. Vervolgens worden een antilichaam tegen een epigenetische marker en controle IgG, elk gelabeld met verschillende DNA-sondes, gebonden aan de respectieve doelen in dezelfde enkele cel.
Nabijheidsligatie wordt geïnduceerd tussen de willekeurige primer en het antilichaam door een connector-DNA toe te voegen met complementaire sequenties aan de scaffold-sequentie van de willekeurige primer en de antilichaam-DNA-sonde. Deze aanpak integreert antilichaaminformatie en nabijgelegen genoomsequenties in een enkel DNA-product van nabijheidsligatie. Door herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk te maken, maakt deze methode een toename van de gegevensdichtheid van een zeldzame cel en statistische analyse mogelijk met alleen IgG- en antilichaamgegevens van dezelfde cel. De herbruikbare afzonderlijke cellen die met deze methode zijn bereid, kunnen minstens een paar maanden worden bewaard en later worden hergebruikt om de epigenetische karakterisering te verbreden en de gegevensdichtheid te verhogen. Deze methode biedt flexibiliteit aan onderzoekers en hun projecten.
Introduction
Single-cell technologie betreedt het tijdperk van single-cell multiomics, dat individuele single-cell omics-technologieën integreert1. Onlangs is single-cell transcriptomics gecombineerd met methoden voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid (scNMT-seq2 en SHARE-seq3) of histonmodificaties (Paired-seq4 en Paired-Tag5). Meer recent werden single-cell transcriptomics en proteomics geïntegreerd met chromatine toegankelijkheid (DOGMA-seq6). Deze methoden maken gebruik van transposase-gebaseerde tagging voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid of histonmodificaties.
Transposase-gebaseerde benaderingen splitsen genomisch DNA en voegen een DNA-streepjescode toe aan het einde van het genomische DNA-fragment. Elk gespleten genomisch fragment kan slechts maximaal twee DNA-barcodes accepteren (= één epigenetisch merkteken per splitsingsplaats), en het genomische DNA op de splitsingsplaats gaat verloren. Daarom hebben op splitsing gebaseerde benaderingen een afweging tussen het aantal geteste epigenetische markeringen en de signaaldichtheid. Dit belemmert de analyse van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel. Een eencellige epigenomische methode die het genomische DNA niet splitst, werd ontwikkeld om dit probleem op te lossen 7,8.
Naast het hierboven genoemde splitsingsprobleem, hebben op transposase gebaseerde benaderingen nog andere beperkingen. Bij eencellige epigenoomanalyse is het van cruciaal belang om de locatie van histonen en DNA-geassocieerde eiwitten op het genoom te kennen. In de huidige benaderingen wordt dit bereikt door gebruik te maken van niet-gefixeerde afzonderlijke cellen en het behoud van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties. Dit genereert echter een sterke bias voor toegankelijke chromatinegebieden, zelfs bij de analyse van histonmodificaties 9. De locatie van histonen en genoom-geassocieerde eiwitten op het genoom kan worden bewaard zonder eiwit-DNA en eiwit-eiwit te vermengen, met behulp van een polyacrylamide scaffold 7,8. Deze benadering vermindert de structurele vertekening die wordt waargenomen in de huidige benaderingen die afhankelijk zijn van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties.
Transposase-gebaseerde benaderingen kunnen slechts één keer signalen van een enkele cel ontvangen. Daarom is het moeilijk om het volledige epigenoom van een enkele cel af te bakenen vanwege het wegvallen van de signalen. Herbruikbare afzonderlijke cellen zijn ontwikkeld om de huidige beperkingen te overwinnen door iteratieve epigenomische analyse in dezelfde enkele cel mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de onlangs gerapporteerde eencellige multi-epigenomische analyse met herbruikbare afzonderlijke cellen7. In de volgende paragrafen bespreken we kritieke punten, waarbij we de nadruk leggen op mogelijke beperkingen in het protocol.
Een van de kritieke punten in het protocol (van stap 7.2-13) is het vermijden van DNase-besmetting. Een enkele cel heeft slechts twee kopieën van genomisch DNA. Daarom vermindert het besc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Drs. David Sanchez-Martin en Christopher B. Buck voor hun commentaar tijdens de conceptualiseringsfase van het project. We bedanken ook de Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health voor hulp bij voorbereidende experimenten en de Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH voor advies in computationele analyse. We bedanken mevrouw Anna Word voor het helpen met de optimalisatie van DNA-polymerasen die in de methode worden gebruikt. Dit werk maakte gebruik van de computationele middelen van het NIHHPC Biowulf-cluster (http://hpc.nih.gov). Dit project wordt ondersteund door het intramurale programma van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, de NCI Director’s Innovation Award (# 397172) en federale fondsen van het National Cancer Institute onder contractnummer HHSN261200800001E. We bedanken Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy en alle leden van het Laboratorium voor Cellulaire Oncologie voor productieve opmerkingen.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
- Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
- Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
- Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
- Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
- Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
- Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
- Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
- Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
