Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Einzelzellmethode für iterative epigenomische Analysen unter Verwendung einer wiederverwendbaren Einzelzelle. Die wiederverwendbare Einzelzelle ermöglicht die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Einzelzelle und die statistische Validierung der Ergebnisse.
Abstract
Aktuelle Einzelzell-Epigenomanalysen sind für den einmaligen Gebrauch konzipiert. Die Zelle wird nach einmaliger Verwendung verworfen, wodurch die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in einer einzelnen Zelle verhindert wird und Daten von anderen Zellen benötigt werden, um das Signal vom experimentellen Hintergrundrauschen in einer einzelnen Zelle zu unterscheiden. In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mit der dieselbe Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen wiederverwendet werden kann.
Bei dieser experimentellen Methode werden zelluläre Proteine zunächst an einem Polyacrylamid-Polymer verankert, anstatt sie mit Protein und DNA zu vernetzen, wodurch strukturelle Verzerrungen verringert werden. Dieser kritische Schritt ermöglicht wiederholte Experimente mit derselben Einzelzelle. Als nächstes wird ein zufälliger Primer mit einer Gerüstsequenz für die Proximity-Ligation an die genomische DNA geglüht, und die genomische Sequenz wird dem Primer durch Erweiterung unter Verwendung einer DNA-Polymerase hinzugefügt. Anschließend werden ein Antikörper gegen einen epigenetischen Marker und Kontroll-IgG, die jeweils mit unterschiedlichen DNA-Sonden markiert sind, an die jeweiligen Ziele in derselben Einzelzelle gebunden.
Die Proximity-Ligation wird zwischen dem Random-Primer und dem Antikörper induziert, indem eine Konnektor-DNA mit komplementären Sequenzen an die Gerüstsequenz des Random-Primers und der Antikörper-DNA-Sonde angehängt wird. Dieser Ansatz integriert Antikörperinformationen und benachbarte Genomsequenzen in einem einzigen DNA-Produkt der Proximity-Ligation. Durch die Ermöglichung wiederholter Experimente mit derselben Einzelzelle ermöglicht diese Methode eine Erhöhung der Datendichte einer seltenen Zelle und eine statistische Analyse, bei der nur IgG- und Antikörperdaten derselben Zelle verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellten wiederverwendbaren Einzelzellen können mindestens einige Monate gelagert und später wiederverwendet werden, um die epigenetische Charakterisierung zu erweitern und die Datendichte zu erhöhen. Diese Methode bietet Forschern und ihren Projekten Flexibilität.
Introduction
Die Single-Cell-Technologie tritt in die Ära der Single-Cell-Multiomics ein, bei der einzelne Single-Cell-Omics-Technologien integriertwerden 1. In jüngster Zeit wurde die Einzelzell-Transkriptomik mit Methoden zum Nachweis der Chromatinzugänglichkeit (scNMT-seq2 und SHARE-seq3) oder Histonmodifikationen (Paired-seq4 und Paired-Tag5) kombiniert. In jüngerer Zeit wurden Einzelzell-Transkriptomik und Proteomik in die Chromatin-Zugänglichkeit integriert (DOGMA-seq6). Diese Methoden verwenden Transposase-basiertes Tagging, um die Zugänglichkeit von Chromatin oder Histonmodifikationen zu erkennen.
Transposase-basierte Ansätze spalten genomische DNA und fügen am Ende des genomischen DNA-Fragments einen DNA-Barcode hinzu. Jedes gespaltene genomische Fragment kann nur bis zu zwei DNA-Barcodes (= eine epigenetische Markierung pro Spaltstelle) aufnehmen, und die genomische DNA an der Spaltstelle geht verloren. Daher haben spaltungsbasierte Ansätze einen Kompromiss zwischen der Anzahl der getesteten epigenetischen Markierungen und der Signaldichte. Dies erschwert die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Zelle. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine einzelzellige epigenomische Methode entwickelt, bei der die genomische DNA nicht gespalten wird 7,8.
Zusätzlich zu dem oben erwähnten Problem der Spaltung weisen Transposase-basierte Ansätze weitere Einschränkungen auf. Bei der Einzelzell-Epigenomanalyse ist es von entscheidender Bedeutung, die Position von Histonen und DNA-assoziierten Proteinen im Genom zu kennen. In aktuellen Ansätzen wird dies durch die Verwendung unfixierter Einzelzellen und die Beibehaltung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen erreicht. Dies führt jedoch zu einer starken Verzerrung zugänglicher Chromatinregionen, selbst bei der Analyse von Histonmodifikationen 9. Die Lage von Histonen und genomassoziierten Proteinen auf dem Genom kann ohne Vernetzung von Protein-DNA und Protein-Protein unter Verwendung eines Polyacrylamid-Gerüsts erhalten werden 7,8. Dieser Ansatz reduziert die strukturelle Verzerrung, die bei aktuellen Ansätzen beobachtet wird, die von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen abhängen.
Transposase-basierte Ansätze können Signale nur einmal von einer einzelnen Zelle erfassen. Daher ist es aufgrund des Abfalls der Signale schwierig, das gesamte Epigenom einer einzelnen Zelle abzugrenzen. Wiederverwendbare Einzelzellen wurden entwickelt, um die derzeitigen Einschränkungen zu überwinden, indem sie eine iterative epigenomische Analyse in derselben Einzelzelle ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll für die kürzlich berichtete multiepigenomische Einzelzellanalyse mit wiederverwendbaren Einzelzellen7. In den folgenden Abschnitten diskutieren wir kritische Punkte und betonen mögliche Einschränkungen des Protokolls.
Einer der kritischen Punkte im gesamten Protokoll (aus den Schritten 7.2-13) ist die Vermeidung einer DNase-Kontamination. Eine einzelne Zelle hat nur zwei Kopien der genomischen DNA. Daher …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. David Sanchez-Martin und Dr. Christopher B. Buck für ihre Kommentare während der Konzeptphase des Projekts. Wir danken auch dem Genomics Core, dem Center for Cancer Research, dem National Cancer Institute, den National Institutes of Health für die Hilfe bei vorläufigen Experimenten und der Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH für die Beratung bei der computergestützten Analyse. Wir danken Frau Anna Word für ihre Hilfe bei der Optimierung der in der Methode verwendeten DNA-Polymerasen. Diese Arbeit nutzte die Rechenressourcen des NIHHPC-Biowulf-Clusters (http://hpc.nih.gov). Dieses Projekt wird durch das Intramurale Programm des Center for Cancer Research, des National Cancer Institute, der National Institutes of Health, des NCI Director’s Innovation Award (#397172) und Bundesmittel des National Cancer Institute unter der Vertragsnummer HHSN261200800001E unterstützt. Wir danken Dr. Tom Misteli, Dr. Carol Thiele, Dr. Douglas R. Lowy und allen Mitgliedern des Laboratory of Cellular Oncology für ihre produktiven Kommentare.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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