Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT & RUN-methode en data-analyseworkflow
Summary
Dit protocol beschrijft een experimentele methode en data-analyse workflow voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans.
Abstract
Regulerende transcriptiefactoren beheersen veel belangrijke biologische processen, waaronder cellulaire differentiatie, reacties op omgevingsverstoringen en -spanningen en gastheer-pathogeeninteracties. Het bepalen van de genoombrede binding van regulerende transcriptiefactoren aan DNA is essentieel om de functie van transcriptiefactoren in deze vaak complexe biologische processen te begrijpen. Splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) is een moderne methode voor genoombrede mapping van in vivo eiwit-DNA-bindingsinteracties die een aantrekkelijk alternatief is voor de traditionele en veel gebruikte chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) -methode. CUT&RUN is geschikt voor een experimentele opstelling met een hogere doorvoer en heeft een aanzienlijk hoger dynamisch bereik met lagere sequencingkosten per monster dan ChIP-seq. Hier worden een uitgebreid CUT&RUN-protocol en bijbehorende data-analyseworkflow beschreven die is toegesneden op genoombrede analyse van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans . Dit gedetailleerde protocol omvat alle noodzakelijke experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen tot bibliotheekvoorbereiding voor sequencing; daarnaast bevat het een aangepaste computationele workflow voor CUT & RUN-gegevensanalyse.
Introduction
Candida albicans is een klinisch relevante, polymorfe menselijke schimmelpathogeen die bestaat in een verscheidenheid aan verschillende groeiwijzen, zoals de planktonische (vrij zwevende) groeiwijze en als gemeenschappen van strak gehechte cellen beschermd door een extracellulaire matrix, bekend als de biofilmmodus van groei 1,2,3. Net als bij andere ontwikkelings- en cellulaire processen is biofilmontwikkeling een belangrijke C. albicans virulentie eigenschap waarvan bekend is dat deze op transcriptioneel niveau wordt gecontroleerd door regulerende transcriptiefactoren (TF’s) die op een sequentiespecifieke manier aan DNA binden4. Onlangs zijn chromatineregulatoren en histonmodifiers ook naar voren gekomen als belangrijke regulatoren van C. albicans biofilmvorming5 en morfogenese6 door dna-toegankelijkheid te bemiddelen. Om de complexe biologie van deze belangrijke schimmelpathogeen te begrijpen, zijn effectieve methoden om de genoombrede lokalisatie van specifieke TF’s te bepalen tijdens verschillende ontwikkelings- en cellulaire processen waardevol.
Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is een veelgebruikte methode om eiwit-DNA interacties in C. albicans 5,6 te onderzoeken en heeft grotendeels de meer klassieke chromatine immunoprecipitatie gevolgd door microarray (ChIP-chip)9 methode vervangen. Zowel ChIP-seq- als ChIP-chipmethoden vereisen echter een groot aantal invoercellen10, wat een complicerende factor kan zijn bij het onderzoeken van TF’s in de context van specifieke monsters en groeiwijzen, zoals biofilms verzameld van patiënten of diermodellen van infectie. Bovendien levert de chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) -test vaak een aanzienlijke hoeveelheid achtergrondsignaal op in het hele genoom, wat een hoge mate van verrijking vereist voor het doelwit van belang om signaal voldoende van ruis te scheiden. Hoewel de ChIP-chip-assay tegenwoordig grotendeels verouderd is, maken de sequencingdieptes die nodig zijn voor ChIP-seq deze test onbetaalbaar voor veel onderzoekers, met name degenen die meerdere TF’s en / of chromatine-geassocieerde eiwitten bestuderen.
Splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease (CUT&RUN) is een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq. Het werd in 2017 ontwikkeld door het Henikoff-lab om de beperkingen van ChIP-seq en chromatine endogene splitsing te omzeilen, gevolgd door sequencing ChEC-seq 11,12, een andere methode om eiwit-DNA-interacties op genoombreed niveau te identificeren, terwijl het hoge resolutie, genoombrede mapping van TF’s en chromatine-geassocieerde eiwittenbiedt 13 . CUT&RUN vertrouwt op de gerichte vertering van chromatine in gepermeabiliseerde kernen met behulp van vastgebonden microkokkennucleasen, gevolgd door sequencing van de verteerde DNA-fragmenten 9,10. Aangezien DNA-fragmenten specifiek worden gegenereerd bij de loci die gebonden zijn door een eiwit van belang, in plaats van door het hele genoom te worden gegenereerd via willekeurige fragmentatie zoals in ChIP-assays, resulteert de CUT & RUN-benadering in sterk verminderde achtergrondsignalen en vereist dus 1/10e van de sequencingdiepte in vergelijking met ChIP-seq11,13, 14. Deze verbeteringen leiden uiteindelijk tot aanzienlijke verlagingen van de sequencingkosten en vermindering van het totale aantal inputcellen dat nodig is als uitgangsmateriaal voor elk monster.
Hier wordt een robuust CUT&RUN-protocol beschreven dat is aangepast en geoptimaliseerd voor het bepalen van de genoombrede lokalisatie van TF’s in C. albicans-cellen geïsoleerd uit biofilms en planktonculturen. Een grondige pijplijn voor gegevensanalyse wordt ook gepresenteerd, die de verwerking en analyse van de resulterende sequentiegegevens mogelijk maakt en vereist dat gebruikers minimale expertise hebben in codering of bio-informatica. In het kort beschrijft dit protocol epitoop-tagging van TF-coderende genen, het oogsten van biofilm- en planktoncellen, isolatie van intacte permeabiliseerde kernen, incubatie met primaire antilichamen tegen het specifieke eiwit of epitoop-gelabelde eiwit van belang, tethering van de chimere A / G-microkokkenkernen (pAG-MNase) fusie-eiwitten aan de primaire antilichamen, genomisch DNA-herstel na chromatinevertering en voorbereiding van genomische DNA-bibliotheken voor sequencing.
Het experimentele CUT&RUN-protocol wordt gevolgd door een speciaal gebouwde pijplijn voor gegevensanalyse, die ruwe DNA-sequencing leest in FASTQ-formaat en alle vereiste verwerkingsstappen implementeert om een volledige lijst te bieden van aanzienlijk verrijkte loci gebonden door de TF van belang (gericht op het primaire antilichaam). Merk op dat meerdere stappen van het beschreven bibliotheekvoorbereidingsprotocol specifiek zijn aangepast en geoptimaliseerd voor CUT & RUN-analyse van TF’s (in tegenstelling tot nucleosomen). Hoewel de gegevens in dit manuscript werden gegenereerd met behulp van TF-specifieke aanpassingen van een commerciële CUT & RUN-kit, zijn deze protocollen ook gevalideerd met behulp van individueel geproduceerde componenten (d.w.z. pAG-MNase-enzym en magnetische DNA-zuiveringsparels) en in-house voorbereide buffers, die de experimentele kosten aanzienlijk kunnen verlagen. De uitgebreide experimentele en data-analyseprotocollen worden hieronder in detail beschreven in een stap-voor-stap formaat. Alle reagentia en kritieke apparatuur, evenals buffer- en mediarecepten, worden vermeld in respectievelijk de tabel met materialen en aanvullend dossier 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol presenteert een uitgebreide experimentele en computationele pijplijn voor genoombrede lokalisatie van regulerende TF’s in C. albicans. Het is ontworpen om zeer toegankelijk te zijn voor iedereen met standaard microbiologie en moleculaire biologie training. Door gebruik te maken van het hoge dynamische bereik en de lage sample input vereisten van de CUT&RUN assay en het opnemen van optimalisaties voor de lokalisatie van TF-DNA binding interacties in C. albicans biofilm en planktonic culturen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken alle voormalige en huidige leden van de laboratoria Nobile en Hernday voor feedback op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) award nummer R35GM124594 en door de familie Kamangar in de vorm van een begiftigde leerstoel aan C.J.N. Dit werk werd ook ondersteund door het NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) awardnummer R15AI137975 aan A.D.H.C.L.E. werd ondersteund door het NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) fellowshipnummer F31DE028488. De inhoud is de exclusieve verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de standpunten van de financiers. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of in de beslissing om de resultaten te publiceren.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
