Этот протокол описывает экспериментальный метод и рабочий процесс анализа данных для расщепления под мишенями и высвобождения с использованием нуклеазы (CUT & RUN) в грибковом патогене человека Candida albicans.
Регуляторные факторы транскрипции контролируют многие важные биологические процессы, включая клеточную дифференцировку, реакции на возмущения окружающей среды и стрессы, а также взаимодействия хозяин-патоген. Определение общегеномного связывания регуляторных факторов транскрипции с ДНК имеет важное значение для понимания функции факторов транскрипции в этих часто сложных биологических процессах. Расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT &RUN) – это современный метод общегеномного картирования белково-ДНК-связывающих взаимодействий in vivo , который является привлекательной альтернативой традиционному и широко используемому иммунопреципитации хроматина с последующим методом секвенирования (ChIP-seq). CUT&RUN поддается экспериментальной установке с более высокой пропускной способностью и имеет значительно более высокий динамический диапазон с более низкими затратами на секвенирование на выборку, чем ChIP-seq. Здесь описан комплексный протокол CUT&RUN и сопутствующий рабочий процесс анализа данных, предназначенный для общегеномного анализа взаимодействий транскрипционного фактора и ДНК-связывания в грибковом патогене человека Candida albicans . Этот подробный протокол включает в себя все необходимые экспериментальные процедуры, от эпитопной маркировки генов, кодирующих фактор транскрипции, до подготовки библиотеки к секвенированию; кроме того, он включает в себя настраиваемый вычислительный рабочий процесс для анализа данных CUT&RUN.
Candida albicans является клинически значимым, полиморфным грибковым патогеном человека, который существует в различных режимах роста, таких как планктонный (свободно плавающий) режим роста и как сообщества плотно прилипших клеток, защищенных внеклеточным матриксом, известным как режим биопленки роста 1,2,3. Подобно другим процессам развития и клеточным процессам, развитие биопленки является важным признаком вирулентности C. albicans, который, как известно, контролируется на уровне транскрипции регуляторными факторами транскрипции (TF), которые связываются с ДНК специфическим для последовательности образом4. В последнее время регуляторы хроматина и модификаторы гистонов также стали важными регуляторами образования биопленки C. albicans 5 и морфогенеза6 путем опосредования доступности ДНК. Для понимания сложной биологии этого важного грибкового патогена ценны эффективные методы определения общегеномной локализации специфических ТФ при различных процессах развития и клеточных процессах.
Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq) является широко используемым методом исследования белково-ДНК-взаимодействий в C. albicans 5,6 и в значительной степени заменила более классическое иммунопреципитацию хроматина с последующим методом микрочипа (ChIP-чип)9. Однако как методы ChIP-seq, так и методы ChIP-чипа требуют большого количества входных клеток10, что может быть осложняющим фактором при исследовании TF в контексте конкретных образцов и режимов роста, таких как биопленки, собранные у пациентов или животных моделей инфекции. Кроме того, анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) часто дает значительное количество фонового сигнала по всему геному, требуя высокого уровня обогащения для интересующей мишени, чтобы достаточно отделить сигнал от шума. В то время как анализ ChIP-чипа сегодня в значительной степени устарел, глубина секвенирования, необходимая для ChIP-seq, делает этот анализ непомерно дорогим для многих исследователей, особенно тех, кто изучает несколько TF и / или хроматин-ассоциированных белков.
Расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT&RUN) является привлекательной альтернативой ChIP-seq. Он был разработан лабораторией Henikoff в 2017 году, чтобы обойти ограничения эндогенного расщепления ChIP-seq и хроматина с последующим секвенированием ChEC-seq11,12, еще одним методом идентификации белково-ДНК-взаимодействий на уровне всего генома, обеспечивая при этом картирование TF и хроматин-ассоциированных белков с высоким разрешением и хроматин-ассоциированных белков13 . CUT&RUN полагается на целенаправленное переваривание хроматина в пермеабилизированных ядрах с использованием привязанных микрококковых нуклеаз с последующим секвенированием переваренных фрагментов ДНК 9,10. Поскольку фрагменты ДНК специально генерируются в локусах, которые связаны интересующим белком, а не генерируются по всему геному путем случайной фрагментации, как в анализах ChIP, подход CUT & RUN приводит к значительному снижению фоновых сигналов и, таким образом, требует 1/10 глубины секвенирования по сравнению с ChIP-seq11,13, 14. Эти улучшения в конечном итоге приводят к значительному сокращению затрат на секвенирование и сокращению общего числа входных ячеек, необходимых в качестве исходного материала для каждого образца.
Здесь описан надежный протокол CUT&RUN, который был адаптирован и оптимизирован для определения общегеномной локализации ТФ в клетках C. albicans , выделенных из биопленок и планктонных культур. Также представлен конвейер тщательного анализа данных, который позволяет обрабатывать и анализировать полученные данные о последовательностях и требует от пользователей минимального опыта в кодировании или биоинформатике. Вкратце, этот протокол описывает эпитопную маркировку TF-кодирующих генов, сбор биопленки и планктонных клеток, выделение интактных пермеабилизированных ядер, инкубацию с первичными антителами против специфического белка или белка, помеченного эпитопом, представляющего интерес, привязку химерных белков A/G-микрококковой нуклеазы (pAG-MNase) к первичным антителам, восстановление геномной ДНК после переваривания хроматина и подготовку геномных библиотек ДНК для секвенирования.
За экспериментальным протоколом CUT&RUN следует специально построенный конвейер анализа данных, который принимает необработанные показания секвенирования ДНК в формате FASTQ и реализует все необходимые этапы обработки, чтобы предоставить полный список значительно обогащенных локусов, связанных интересующим TF (нацеленных на первичное антитело). Обратите внимание, что несколько шагов описанного протокола подготовки библиотеки были специально адаптированы и оптимизированы для анализа CUT&RUN TF (в отличие от нуклеосом). В то время как данные, представленные в этой рукописи, были сгенерированы с использованием TF-специфических адаптаций коммерческого набора CUT & RUN, эти протоколы также были проверены с использованием компонентов из отдельных источников (т. Е. Фермента pAG-MNase и магнитных шариков очистки ДНК) и внутренних буферов, которые могут значительно снизить экспериментальные затраты. Комплексные протоколы экспериментов и анализа данных подробно описаны ниже в пошаговом формате. Все реагенты и критическое оборудование, а также рецепты буферов и сред перечислены в Таблице материалов и Дополнительном файле 1 соответственно.
Этот протокол представляет собой комплексный экспериментальный и вычислительный конвейер для общегеномной локализации регуляторных TF в C. albicans. Он разработан, чтобы быть очень доступным для всех, кто имеет стандартную подготовку в области микробиологии и молекулярной биологии. И…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех бывших и нынешних членов лабораторий Nobile и Hernday за отзывы о рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) Национального института общих медицинских наук (NIGMS) под номером R35GM124594 и семьей Камангаров в виде наделенной кафедры C.J.N. Эта работа также была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний NIH (NIAID) с присвоением номера R15AI137975 A.D.H.C.L.E. была поддержана стипендией Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований NIH (NIDCR) F31DE028488. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает точку зрения спонсоров. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи; или в решении опубликовать результаты.
0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
Agar | Criterion | C5001 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
Fluorescence microscope | User-dependent | ||
Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
High-speed centrifuge | User-dependent | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
Lens paper | VWR | 52846-001 | |
Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
NaCl | VWR | 470302-522 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
Thermocycler | User-dependent | ||
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
Yeast extract | Criterion | C7341 | |
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |