פרוטוקול זה מתאר שיטה ניסיונית וזרימת עבודה של ניתוח נתונים עבור ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס.
גורמי שעתוק רגולטוריים שולטים בתהליכים ביולוגיים חשובים רבים, כולל התמיינות תאית, תגובות להפרעות ולחצים סביבתיים, ואינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. קביעת הקשירה הכלל-גנומית של גורמי שעתוק רגולטוריים לדנ”א חיונית להבנת תפקידם של גורמי שעתוק בתהליכים ביולוגיים מורכבים אלה. ביקוע תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) היא שיטה מודרנית למיפוי כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות חלבון-דנ”א in vivo המהווה חלופה אטרקטיבית לתפיסת החיסון המסורתית והנפוצה של כרומטין ואחריה לריצוף (ChIP-seq). CUT&RUN מקובל על מערך ניסיוני בעל תפוקה גבוהה יותר ויש לו טווח דינמי גבוה משמעותית עם עלויות ריצוף נמוכות יותר לכל מדגם מאשר ChIP-seq. כאן מתוארים פרוטוקול CUT&RUN מקיף וזרימת עבודה נלווית של ניתוח נתונים המותאמים לניתוח כלל-גנומי של אינטראקציות קושרות גורמי שעתוק-DNA בפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס . פרוטוקול מפורט זה כולל את כל ההליכים הניסוייים הדרושים, החל מתיוג אפיטופים של גנים המקודדים גורמי שעתוק וכלה בהכנת ספרייה לריצוף; בנוסף, הוא כולל זרימת עבודה חישובית מותאמת אישית לניתוח נתונים CUT&RUN.
קנדידה אלביקנס היא פתוגן פטרייתי אנושי פולימורפי רלוונטי מבחינה קלינית, שקיים במגוון מצבי גדילה שונים, כגון מצב הצמיחה הפלנקטוני (צף חופשי) וכקהילות של תאים דבוקים היטב המוגנים על ידי מטריצה חוץ-תאית, המכונה מצב הביופילם של צמיחה 1,2,3. בדומה לתהליכים התפתחותיים ותאיים אחרים, פיתוח ביופילם הוא תכונת אלימות חשובה של C. albicans, הידועה כמבוקרת ברמת השעתוק על ידי גורמי שעתוק רגולטוריים (TFs) הנקשרים לדנ”א באופן ספציפי לרצף4. לאחרונה, רגולטורים של כרומטין ומשני היסטון התגלו גם כרגולטורים חשובים של היווצרות ביופילם C. albicans 5 ומורפוגנזה6 על ידי תיווך נגישות DNA. כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של הפתוגן הפטרייתי החשוב הזה, שיטות יעילות לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs ספציפיים במהלך תהליכים התפתחותיים ותאיים שונים הן בעלות ערך.
קדם חיסוני של כרומטין ואחריו ריצוף (ChIP-seq) היא שיטה נפוצה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ”א ב- C. albicans 5,6 והחליפה במידה רבה את מערכת החיסון הקלאסית יותר של כרומטין ואחריה את שיטת המיקרו-מערך (ChIP-chip)9. עם זאת, הן שיטות ChIP-seq והן ChIP-chip דורשות מספר רב של תאי קלט10, מה שיכול להיות גורם מסבך כאשר חוקרים TFs בהקשר של דגימות ספציפיות ודרכי גדילה, כגון ביופילמים שנאספו מחולים או מודלים של זיהום בעלי חיים. בנוסף, בדיקת הכרומטין החיסונית (ChIP) מניבה לעתים קרובות כמות משמעותית של אות רקע לאורך הגנום, הדורשת רמה גבוהה של העשרה עבור המטרה המעניינת כדי להפריד מספיק את האות מהרעש. בעוד שהבדיקה של ChIP-chip מיושנת במידה רבה כיום, עומקי הריצוף הדרושים ל-ChIP-seq הופכים את הבדיקה הזו ליקרה מאוד עבור חוקרים רבים, במיוחד אלה שחוקרים מספר TFs ו/או חלבונים הקשורים לכרומטין.
מחשוף תחת מטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN) הוא חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq. הוא פותח על ידי מעבדת Henikoff בשנת 2017 כדי לעקוף את המגבלות של ChIP-seq ו chromatin endogenous cleavage ואחריו רצף ChEC-seq11,12, שיטה נוספת לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA ברמה כלל-גנומית, תוך מתן מיפוי רחב גנום ברזולוציה גבוהה של TFs וחלבונים הקשורים לכרומטין13 . CUT&RUN מסתמך על עיכול ממוקד של כרומטין בתוך גרעינים חודרים באמצעות נוקלאזות מיקרו-קוקליות קשורות, ולאחר מכן ריצוף של מקטעי הדנ”א המעוכלים 9,10. מכיוון שמקטעי דנ”א נוצרים באופן ספציפי במוקדים הקשורים לחלבון בעל עניין, במקום להיווצר לאורך כל הגנום באמצעות פיצול אקראי כמו במבחני ChIP, גישת CUT&RUN מביאה להפחתהמשמעותית של אותות רקע, ולכן דורשת 1/10 מעומק הריצוף בהשוואה ל-ChIP-seq11,13, 14. שיפורים אלה מובילים בסופו של דבר להפחתה משמעותית בעלויות הריצוף ולהפחתה במספר הכולל של תאי הקלט הדרושים כחומר התחלתי עבור כל דגימה.
כאן מתואר פרוטוקול CUT&RUN חזק שהותאם והותאם ומוטב לקביעת לוקליזציה כלל-גנומית של TFs בתאי C. albicans שבודדו מביופילמים ותרביות פלנקטוניות. כמו כן מוצג צינור ניתוח נתונים יסודי, המאפשר עיבוד וניתוח של נתוני הרצף המתקבלים ודורש מהמשתמשים מומחיות מינימלית בקידוד או בביואינפורמטיקה. בקצרה, פרוטוקול זה מתאר תיוג אפיטופים של גנים המקודדים TF, קצירת תאים ביופילם ופלנקטוניים, בידוד של גרעינים חודרים שלמים, דגירה עם נוגדנים ראשוניים כנגד החלבון הספציפי או החלבון המתויג באפיטופ, קשירת חלבוני ההיתוך הכימריים A/G-micrococcal Nuclease (pAG-MNase) לנוגדנים העיקריים, התאוששות DNA גנומית לאחר עיכול כרומטין, והכנת ספריות DNA גנומיות לריצוף.
פרוטוקול CUT&RUN הניסיוני מלווה בצנרת ניתוח נתונים ייעודית, שלוקחת קריאות ריצוף DNA גולמיות בפורמט FASTQ ומיישמת את כל שלבי העיבוד הנדרשים כדי לספק רשימה מלאה של מוקדים מועשרים באופן משמעותי הקשורים ל- TF של עניין (ממוקד על ידי הנוגדן העיקרי). שים לב ששלבים מרובים של פרוטוקול הכנת הספרייה המתואר הותאמו והותאמו במיוחד לניתוח CUT&RUN של TFs (בניגוד לנוקלאוזומים). בעוד שהנתונים המוצגים בכתב יד זה נוצרו באמצעות התאמות ספציפיות ל-TF של ערכת CUT&RUN מסחרית, פרוטוקולים אלה אומתו גם באמצעות רכיבים שמקורם בנפרד (כלומר, אנזים pAG-MNase וחרוזי טיהור DNA מגנטיים) ובמאגרים מוכנים בתוך הבית, מה שיכול להפחית באופן משמעותי את עלות הניסוי. פרוטוקולי הניסוי וניתוח הנתונים המקיפים מתוארים בפירוט להלן בפורמט שלב אחר שלב. כל הריאגנטים והציוד הקריטי, כמו גם מתכוני המאגר והמדיה, מפורטים בטבלת החומרים ובקובץ המשלים 1, בהתאמה.
פרוטוקול זה מציג צינור ניסיוני וחישובי מקיף ללוקליזציה כלל-גנומית של TFs רגולטוריים ב- C. albicans. הוא מתוכנן להיות נגיש מאוד לכל מי שיש לו הכשרה סטנדרטית במיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית. על ידי מינוף הטווח הדינמי הגבוה ודרישות קלט הדגימה הנמוכות של מבחן CUT&RUN וכולל אופטימיזציות ללוקלי?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכל חברי מעבדות נובל והרנדאי בעבר ובהווה על המשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) מספר R35GM124594 ועל ידי משפחת קמנגר בצורה של כיסא ניחן ל- C.J.N. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של NIH (NIAID) מספר R15AI137975 ל- A.D.H.C.L.E. נתמך על ידי מלגת המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי של NIH (NIDCR) מספר מלגת F31DE028488. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג את דעותיהם של המממנים. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; או בהחלטה לפרסם את התוצאות.
0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
Agar | Criterion | C5001 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
Fluorescence microscope | User-dependent | ||
Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
High-speed centrifuge | User-dependent | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
Lens paper | VWR | 52846-001 | |
Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
NaCl | VWR | 470302-522 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
Thermocycler | User-dependent | ||
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
Yeast extract | Criterion | C7341 | |
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |