Perfil em todo o genoma das interações de vinculação fator de transcrição-DNA em albicanos candida: um método abrangente CUT&RUN e fluxo de trabalho de análise de dados
Summary
Este protocolo descreve um método experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) no patógeno fúngico humano Candida albicans.
Abstract
Os fatores de transcrição regulatória controlam muitos processos biológicos importantes, incluindo diferenciação celular, respostas a perturbações e tensões ambientais e interações hospedeiro-patógeno. Determinar a vinculação em todo o genoma dos fatores de transcrição regulatória ao DNA é essencial para entender a função dos fatores de transcrição nesses processos biológicos muitas vezes complexos. O decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) é um método moderno para mapeamento em todo o genoma de interações de ligação proteína-DNA in vivo que é uma alternativa atraente para a imunoprecipitação de cromatina tradicional e amplamente utilizada seguida pelo método de sequenciamento (ChIP-seq). A CUT&RUN é agradável para uma configuração experimental de maior rendimento e tem um alcance dinâmico substancialmente maior com custos de sequenciamento por amostra mais baixos do que o ChIP-seq. Aqui, um protocolo abrangente da CUT&RUN e um fluxo de trabalho de análise de dados adaptado para análise em todo o genoma das interações de vinculação fator-DNA no patógeno fúngico humano Candida albicans são descritos . Este protocolo detalhado inclui todos os procedimentos experimentais necessários, desde a marcação de epítope de genes de codificação de fatores de transcrição até a preparação da biblioteca para sequenciamento; além disso, inclui um fluxo de trabalho computacional personalizado para análise de dados CUT&RUN.
Introduction
Candida albicans é um patógeno fúngico humano polimórfico clinicamente relevante que existe em uma variedade de diferentes modos de crescimento, como o modo de crescimento planctônico (livre flutuante) e como comunidades de células fortemente aderidas protegidas por uma matriz extracelular, conhecida como o modo de crescimento biofilm 1,2,3. Semelhante a outros processos de desenvolvimento e celulares, o desenvolvimento de biofilmes é um importante traço de virulência de C. albicans que é conhecido por ser controlado no nível transcricional por fatores de transcrição regulatória (TFs) que se ligam ao DNA de forma específica de sequência4. Recentemente, reguladores de cromatina e modificadores de histonas também surgiram como importantes reguladores da formação de biofilme C. albicans 5 e morfogênese6 mediando a acessibilidade do DNA. Para entender a biologia complexa deste importante patógeno fúngico, métodos eficazes para determinar a localização em todo o genoma de TFs específicos durante processos distintos de desenvolvimento e celular são valiosos.
A imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento (ChIP-seq) é um método amplamente utilizado para investigar interações proteína-DNA em C. albicans 5,6 e substituiu em grande parte a imunoprecipitação de cromatina mais clássica seguida pelo método de microarray (ChIP-chip)9. Tanto os métodos chip-seq quanto chip-chip, no entanto, requerem um grande número de células de entrada10, o que pode ser um fator complicador ao investigar TFs no contexto de amostras específicas e modos de crescimento, como biofilmagens coletadas de pacientes ou modelos animais de infecção. Além disso, o ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) muitas vezes produz uma quantidade significativa de sinal de fundo em todo o genoma, exigindo um alto nível de enriquecimento para o alvo de interesse para separar suficientemente o sinal do ruído. Embora o ensaio do chip ChIP esteja em grande parte desatualizado hoje, as profundidades de sequenciamento necessárias para o ChIP-seq tornam este ensaio proibitivamente caro para muitos pesquisadores, particularmente aqueles que estudam múltiplos TFs e/ou proteínas associadas à cromatina.
O decote sob metas e liberação usando nuclease (CUT&RUN) é uma alternativa atraente ao ChIP-seq. Foi desenvolvido pelo laboratório Henikoff em 2017 para contornar as limitações do decote endógeno chip-seq e cromatina seguido pelo sequenciamento ChEC-seq11,12, outro método para identificar interações proteína-DNA em um nível genoma-em todo o genoma, ao mesmo tempo em que fornece mapeamento de alta resolução, genoma-em toda a proteína13 . A CUT&RUN conta com a digestão direcionada da cromatina dentro de núcleos permeabilizados usando nucleases microcóccal amarradas, seguida pelo sequenciamento dos fragmentos de DNA digeridos 9,10. Como fragmentos de DNA são especificamente gerados no loci que são vinculados por uma proteína de interesse, em vez de serem gerados em todo o genoma através de fragmentação aleatória como nos ensaios chip, a abordagem CUT&RUN resulta em sinais de fundo muito reduzidos e, portanto, requer 1/10 da profundidade de sequenciamento em comparação com ChIP-seq11,13, 14 anos. Essas melhorias, em última análise, levam a reduções significativas nos custos de sequenciamento e reduções no número total de células de entrada necessárias como material inicial para cada amostra.
Aqui, é descrito um robusto protocolo CUT&RUN que foi adaptado e otimizado para determinar a localização em todo o genoma de TFs em células de C. albicans isoladas de biofilmes e culturas planctônicas. Também é apresentado um pipeline de análise de dados minucioso, que permite o processamento e análise dos dados de sequência resultantes e exige que os usuários tenham experiência mínima em codificação ou bioinformática. Resumidamente, este protocolo descreve a marcação de epítopes de genes codificadores de TF, colheita de biofilme e células planctônicas, isolamento de núcleos permeabilizados intactos, incubação com anticorpos primários contra a proteína específica ou proteína marcada por epítope de interesse, amarração das proteínas de fusão quimrica A/G-microcóccal (pAG-MNase) para os anticorpos primários, recuperação genômica do DNA após digestão da cromatina e preparação de bibliotecas genômicas de DNA para sequenciamento.
O protocolo EXPERIMENTAL CUT&RUN é seguido por um pipeline de análise de dados construído com propósito, que leva leituras brutas de sequenciamento de DNA no formato FASTQ e implementa todas as etapas de processamento necessárias para fornecer uma lista completa de loci significativamente enriquecido vinculado pelo TF de interesse (direcionado pelo anticorpo primário). Observe que várias etapas do protocolo de preparação da biblioteca descrito foram especificamente adaptadas e otimizadas para análise de CUT&RUN de TFs (em oposição aos nucleosmos). Embora os dados apresentados neste manuscrito tenham sido gerados usando adaptações específicas de TF de um kit comercial CUT&RUN, esses protocolos também foram validados usando componentes de origem individual (ou seja, enzima pAG-MNase e contas de purificação de DNA magnético) e tampões de purificação de DNA em casa, o que pode reduzir significativamente o custo experimental. Os protocolos abrangentes de análise experimental e de dados são descritos em detalhes abaixo em um formato passo a passo. Todos os reagentes e equipamentos críticos, bem como receitas tampão e mídia, estão listados na Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta um abrangente pipeline experimental e computacional para localização de TFs regulatórios em C. albicans. Ele foi projetado para ser altamente acessível a qualquer pessoa com treinamento padrão de microbiologia e biologia molecular. Ao aproveitar o alto alcance dinâmico e os baixos requisitos de entrada de amostras do ensaio CUT&RUN e incluindo otimizações para a localização de interações de ligação TF-DNA em culturas biofilmes c. albicans e planktônicas, este prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros passados e presentes dos laboratórios Nobile e Hernday pelo feedback sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) Do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) número R35GM124594 e pela família Kamangar na forma de uma cadeira dotada para C.J.N. Este trabalho também foi apoiado pelo nih National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) número de premiação R15AI137975 a A.D.H.C.L.E. foi apoiado pelo nih National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) número de bolsas F31DE028488. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa a opinião dos financiadores. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo; na coleta, análises ou interpretação de dados; na escrita do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
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