이 프로토콜은 인간 곰팡이 병원균 칸 디다 알비칸스에서 뉴클레아제(CUT&RUN)를 사용하여 표적 하에서의 절단 및 방출을 위한 실험 방법 및 데이터 분석 워크플로우를 기술한다.
조절 전사 인자는 세포 분화, 환경 혼란 및 스트레스에 대한 반응, 숙주 – 병원체 상호 작용을 포함한 많은 중요한 생물학적 과정을 제어합니다. DNA에 대한 조절 전사 인자의 게놈 전체 결합을 결정하는 것은 이러한 종종 복잡한 생물학적 과정에서 전사 인자의 기능을 이해하는 데 필수적이다. 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 표적 및 방출 하에서의 절단은 시퀀싱 (ChIP-seq) 방법에 이어 전통적이고 널리 사용되는 크로마틴 면역침전에 대한 매력적인 대안인 생체내 단백질-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 매핑을 위한 현대적인 방법이다. CUT&RUN은 더 높은 처리량의 실험 설정을 적용할 수 있으며 ChIP-seq보다 샘플당 시퀀싱 비용이 낮고 동적 범위가 상당히 높습니다. 여기에서는 인간 진균 병원균 칸 디다 알비칸 스에서 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 분석을 위해 맞춤화된 포괄적인 CUT&RUN 프로토콜 및 수반되는 데이터 분석 워크플로우가 설명된다. 이 상세한 프로토콜은 전사 인자-코딩 유전자의 에피토프 태깅으로부터 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비에 이르기까지 필요한 모든 실험 절차를 포함한다; 또한 CUT&RUN 데이터 분석을 위한 맞춤형 계산 워크플로우가 포함되어 있습니다.
칸디다 알비칸스는 임상적으로 관련성이 있는, 다형성 인간 진균 병원체로서, 플랑크톤(free-floating) 성장 모드 및 세포외 매트릭스에 의해 보호되는 단단히 부착된 세포의 군집으로서 1,2,3의 생물막 성장 모드로 알려져 있다. 다른 발달 및 세포 과정과 유사하게, 생물막 개발은 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 조절 전사 인자 (TFs)에 의해 전사 수준에서 조절되는 것으로 알려진 중요한 C. 알비칸 독성 특성이다4. 최근에, 크로마틴 조절제 및 히스톤 개질제는 또한 DNA 접근성을 매개함으로써 C. 알비칸 생물막 형성5 및 형태형성6의 중요한 조절제로서 등장하였다. 이 중요한 곰팡이 병원체의 복잡한 생물학을 이해하기 위해, 뚜렷한 발달 및 세포 과정 동안 특정 TF의 게놈 전체 국소화를 결정하는 효과적인 방법이 중요합니다.
크로마틴 면역침전에 이어 시퀀싱(ChIP-seq)은 C. 알비칸5,6에서 단백질-DNA 상호작용을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이며, 마이크로어레이(ChIP-chip)9 방법에 이어 보다 고전적인 크로마틴 면역침전을 대체하고 있다. 그러나 ChIP-seq 및 ChIP-chip 방법 둘 다 많은 수의 입력 세포(10)를 필요로 하며, 이는 환자 또는 감염의 동물 모델로부터 수집된 생물막과 같은 특정 샘플 및 성장 모드의 맥락에서 TF를 조사할 때 복잡한 인자가 될 수 있다. 또한, 크로마틴 면역침전 (ChIP) 분석은 종종 게놈 전체에 걸쳐 상당한 양의 배경 신호를 산출하며, 관심있는 표적에 대해 높은 수준의 농축이 필요하여 신호를 노이즈로부터 충분히 분리한다. ChIP-chip 분석은 오늘날 대부분 구식이지만, ChIP-seq 에 필요한 시퀀싱 깊이는 많은 연구자, 특히 여러 TF 및 / 또는 크로마틴 관련 단백질을 연구하는 연구자에게이 분석을 엄청나게 비싸게 만듭니다.
표적 하에서의 절단 및 뉴클레아제 (CUT&RUN)를 이용한 방출은 ChIP-seq에 대한 매력적인 대안이다. 2017년 Henikoff 연구실에서 ChIP-seq 및 크로마틴 내인성 절단의 한계를 우회한 후 ChEC-seq 11,12를 시퀀싱하여 게놈 전체 수준에서 단백질-DNA 상호작용을 확인하는 또 다른 방법인 TF 및 크로마틴 관련 단백질의 고분해능, 게놈 전체 매핑을 제공하기 위해 개발되었다(13) . CUT&RUN은 테더링된 미세구균 핵을 사용하여 투과된 핵 내에서 크로마틴의 표적 소화에 의존하고, 이어서 소화된 DNA 단편 9,10의 시퀀싱에 의존한다. DNA 단편은 ChIP 분석에서와 같이 무작위 단편화를 통해 게놈 전체에 걸쳐 생성되기보다는 관심있는 단백질에 의해 결합되는 유전자좌에서 특이적으로 생성되기 때문에 CUT&RUN 접근법은 배경 신호를 크게 감소시키고, 따라서 ChIP-서열 11,13에 비해 시퀀싱 깊이의1/10 번째를 필요로 하며, 14. 이러한 개선은 궁극적으로 시퀀싱 비용을 크게 줄이고 각 샘플의 출발 물질로 필요한 총 입력 셀 수를 줄입니다.
여기에서, 생물막 및 플랑크톤 배양물로부터 분리된 C. 알비칸 세포에서 TFs의 게놈 전체 국소화를 결정하기 위해 적응되고 최적화된 강력한 CUT&RUN 프로토콜이 기술된다. 철저한 데이터 분석 파이프 라인도 제공되어 결과 시퀀스 데이터를 처리 및 분석 할 수 있으며 사용자는 코딩 또는 생물 정보학에 대한 최소한의 전문 지식을 필요로합니다. 간략하게, 이 프로토콜은 TF 코딩 유전자의 에피토프 태깅, 생물막 및 플랑크톤 세포의 수확, 무손상 투과화된 핵의 단리, 관심있는 특정 단백질 또는 에피토프 태깅된 단백질에 대한 일차 항체와의 인큐베이션, 키메라 A/G-마이크로코카셀 뉴클레아제(pAG-MNase) 융합 단백질을 일차 항체에 테더링, 염색질 소화 후 게놈 DNA 회수, 시퀀싱을 위한 게놈 DNA 라이브러리의 제조를 기술한다.
실험적 CUT&RUN 프로토콜은 FASTQ 형식으로 원시 DNA 시퀀싱 판독을 취하고 필요한 모든 처리 단계를 구현하여 관심 TF에 의해 결합된 상당히 풍부한 유전자좌의 전체 목록을 제공하는 특수 목적의 데이터 분석 파이프라인이 뒤따릅니다(기본 항체에 의해 표적화됨). 설명된 라이브러리 준비 프로토콜의 여러 단계는 TF의 CUT&RUN 분석을 위해 특별히 조정되고 최적화되었습니다(뉴클레오솜과는 반대). 이 원고에 제시된 데이터는 상용 CUT&RUN 키트의 TF 특이적 적응을 사용하여 생성되었지만, 이러한 프로토콜은 개별적으로 공급되는 성분(즉, pAG-MNase 효소 및 자기 DNA 정제 비드)과 사내에서 제조된 완충액을 사용하여 검증되었으며, 이는 실험 비용을 상당히 절감할 수 있다. 포괄적인 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 아래에 단계별 형식으로 자세히 설명되어 있습니다. 버퍼 및 미디어 레시피뿐만 아니라 모든 시약 및 중요 장비는 각각 재료 표 및 보충 파일 1에 나열되어 있습니다.
이 프로토콜은 C. albicans에서 규제 TF의 게놈 전체 현지화를위한 포괄적 인 실험 및 계산 파이프 라인을 제공합니다. 표준 미생물학 및 분자 생물학 교육을받은 모든 사람이 쉽게 접근 할 수 있도록 설계되었습니다. CUT&RUN 분석의 높은 동적 범위와 낮은 시료 입력 요구 사항을 활용하고 C. 알비칸 생물막 및 플랑크톤 배양에서 TF-DNA 결합 상호작용의 국산화를 위한 최적화를 포함함으로?…
The authors have nothing to disclose.
원고에 대한 피드백에 대해 Nobile 및 Hernday 연구소의 과거와 현재의 모든 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH) 국립 일반 의료 과학 연구소 (NIGMS) 상 번호 R35GM124594와 C.J.N.에 부여 된 의자의 형태로 Kamangar 가족에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 또한 NIH 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 상 번호 R15AI137975 A.D.H.L.E.에 의해 지원되었.C NIH 국립 치과 및 두개골 안면 연구 연구소 (NIDCR) 펠로우십 번호 F31DE028488에 의해 지원되었습니다. 내용은 저자의 전적인 책임이며 자금 제공자의 견해를 대표하지 않습니다. 기금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할을하지 못했습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석에서; 원고의 쓰기에; 또는 결과를 게시하기로 결정했습니다.
0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
Agar | Criterion | C5001 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
Fluorescence microscope | User-dependent | ||
Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
High-speed centrifuge | User-dependent | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
Lens paper | VWR | 52846-001 | |
Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
NaCl | VWR | 470302-522 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
Thermocycler | User-dependent | ||
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
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Yeast extract | Criterion | C7341 | |
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |