Profilage à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez Candida albicans: une méthode CUT&RUN complète et un flux de travail d’analyse des données
Summary
Ce protocole décrit une méthode expérimentale et un flux de travail d’analyse des données pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléase (CUT&RUN) dans l’agent pathogène fongique humain Candida albicans.
Abstract
Les facteurs de transcription régulateurs contrôlent de nombreux processus biologiques importants, y compris la différenciation cellulaire, les réponses aux perturbations et aux stress environnementaux et les interactions hôte-pathogène. Déterminer la liaison à l’échelle du génome des facteurs de transcription régulateurs à l’ADN est essentiel pour comprendre la fonction des facteurs de transcription dans ces processus biologiques souvent complexes. Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de la nucléase (CUT&RUN) est une méthode moderne de cartographie à l’échelle du génome des interactions in vivo de liaison protéine-ADN qui constitue une alternative attrayante à la méthode traditionnelle et largement utilisée d’immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq). CUT&RUN se prête à une configuration expérimentale à haut débit et a une plage dynamique nettement plus élevée avec des coûts de séquençage par échantillon inférieurs à ceux de ChIP-seq. Ici, un protocole CUT&RUN complet et un flux de travail d’analyse de données d’accompagnement adapté à l’analyse à l’échelle du génome des interactions de liaison facteur de transcription-ADN chez l’agent pathogène fongique humain Candida albicans sont décrits . Ce protocole détaillé comprend toutes les procédures expérimentales nécessaires, du marquage épitope des gènes codant pour le facteur de transcription à la préparation de la bibliothèque pour le séquençage; en outre, il comprend un flux de travail de calcul personnalisé pour l’analyse des données CUT&RUN.
Introduction
Candida albicans est un agent pathogène fongique humain polymorphe cliniquement pertinent qui existe dans une variété de modes de croissance différents, tels que le mode de croissance planctonique (flottant librement) et sous forme de communautés de cellules étroitement adhérentes protégées par une matrice extracellulaire, connue sous le nom de mode de croissance du biofilm 1,2,3. Semblable à d’autres processus développementaux et cellulaires, le développement du biofilm est un trait de virulence important de C. albicans qui est connu pour être contrôlé au niveau transcriptionnel par des facteurs de transcription régulateurs (TF) qui se lient à l’ADN d’une manière spécifique à la séquence4. Récemment, les régulateurs de chromatine et les modificateurs d’histones sont également apparus comme des régulateurs importants de la formation de biofilm5 de C. albicans et de la morphogenèse6 en médiant l’accessibilité de l’ADN. Pour comprendre la biologie complexe de cet important agent pathogène fongique, des méthodes efficaces pour déterminer la localisation à l’échelle du génome de TF spécifiques au cours de processus développementaux et cellulaires distincts sont précieuses.
L’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’un séquençage (ChIP-seq) est une méthode largement utilisée pour étudier les interactions protéine-ADN chez C. albicans 5,6 et a largement remplacé l’immunoprécipitation plus classique de la chromatine suivie de la méthode du microréseau (puce ChIP)9. Cependant, les méthodes ChIP-seq et ChIP-chip nécessitent un grand nombre de cellules d’entrée10, ce qui peut être un facteur de complication lors de l’étude des TF dans le contexte d’échantillons et de modes de croissance spécifiques, tels que des biofilms prélevés sur des patients ou des modèles animaux d’infection. En outre, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) produit souvent une quantité importante de signal de fond dans tout le génome, nécessitant un niveau élevé d’enrichissement pour que la cible d’intérêt sépare suffisamment le signal du bruit. Bien que le test de la puce ChIP soit largement obsolète aujourd’hui, les profondeurs de séquençage nécessaires pour ChIP-seq rendent ce test prohibitif pour de nombreux chercheurs, en particulier ceux qui étudient plusieurs TF et / ou protéines associées à la chromatine.
Le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT&RUN) est une alternative attrayante au ChIP-seq. Il a été développé par le laboratoire Henikoff en 2017 pour contourner les limites du clivage endogène ChIP-seq et chromatine suivi du séquençage ChEC-seq11,12, une autre méthode permettant d’identifier les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome, tout en fournissant une cartographie à haute résolution et à l’échelle du génome des TF et des protéines associées à la chromatine13 . CUT&RUN s’appuie sur la digestion ciblée de la chromatine dans les noyaux perméabilisés à l’aide de nucléases micrococciques attachées, suivie du séquençage des fragments d’ADN digérés 9,10. Comme les fragments d’ADN sont spécifiquement générés aux loci qui sont liés par une protéine d’intérêt, plutôt que d’être générés dans tout le génome par fragmentation aléatoire comme dans les tests ChIP, l’approche CUT&RUN entraîne une réduction considérable des signaux de fond et, par conséquent, nécessite 1/10ème de la profondeur de séquençage par rapport à ChIP-seq11,13, 14. Ces améliorations conduisent finalement à des réductions significatives des coûts de séquençage et à des réductions du nombre total de cellules d’entrée nécessaires comme matériau de départ pour chaque échantillon.
Ici, un protocole CUT&RUN robuste est décrit qui a été adapté et optimisé pour déterminer la localisation à l’échelle du génome des TF dans les cellules de C. albicans isolées à partir de biofilms et de cultures planctoniques. Un pipeline d’analyse de données approfondi est également présenté, ce qui permet le traitement et l’analyse des données de séquence résultantes et nécessite que les utilisateurs aient une expertise minimale en codage ou en bioinformatique. En bref, ce protocole décrit le marquage épitope des gènes codant pour TF, la récolte de biofilms et de cellules planctoniques, l’isolement de noyaux perméabilisés intacts, l’incubation avec des anticorps primaires contre la protéine spécifique ou la protéine marquée par épitope d’intérêt, l’attache des protéines de fusion chimériques A/G-micrococciques (pAG-MNase) aux anticorps primaires, la récupération de l’ADN génomique après la digestion de la chromatine et la préparation de bibliothèques d’ADN génomique pour le séquençage.
Le protocole expérimental CUT&RUN est suivi d’un pipeline d’analyse de données spécialement conçu, qui prend des lectures de séquençage de l’ADN brut au format FASTQ et met en œuvre toutes les étapes de traitement requises pour fournir une liste complète des loci significativement enrichis liés par le TF d’intérêt (ciblé par l’anticorps primaire). Notez que plusieurs étapes du protocole de préparation de bibliothèque décrit ont été spécifiquement adaptées et optimisées pour l’analyse CUT&RUN des TF (par opposition aux nucléosomes). Bien que les données présentées dans ce manuscrit aient été générées à l’aide d’adaptations spécifiques à TF d’un kit CUT&RUN commercial, ces protocoles ont également été validés à l’aide de composants provenant de sources individuelles (c.-à-d. l’enzyme pAG-MNase et les billes de purification magnétique de l’ADN) et de tampons préparés en interne, ce qui peut réduire considérablement les coûts expérimentaux. Les protocoles expérimentaux et d’analyse de données complets sont décrits en détail ci-dessous dans un format étape par étape. Tous les réactifs et l’équipement essentiel, ainsi que les recettes de tampons et de supports, sont énumérés dans le tableau des matériaux et le dossier supplémentaire 1, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente un pipeline expérimental et informatique complet pour la localisation à l’échelle du génome des TF régulateurs chez C. albicans. Il est conçu pour être hautement accessible à toute personne ayant une formation standard en microbiologie et en biologie moléculaire. En tirant parti de la plage dynamique élevée et des faibles exigences d’entrée d’échantillon du test CUT&RUN et en incluant des optimisations pour la localisation des interactions de liaison TF-ADN dans le biofi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres passés et présents des laboratoires Nobile et Hernday pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le national institutes of health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numéro de prix R35GM124594 et par la famille Kamangar sous la forme d’une chaire dotée à C.J.N. Ce travail a également été soutenu par le NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) numéro de bourse R15AI137975 à A.D.H.C.L.E. a été soutenu par le NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) numéro de bourse F31DE028488. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue des bailleurs de fonds. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données; dans la rédaction du manuscrit; ou dans la décision de publier les résultats.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
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