La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

Summary

La spectroscopie de rétrodiffusion neutronique offre un accès non destructif et sans marquage à la dynamique ps-ns des protéines et de leur eau d’hydratation. Le flux de travail est présenté avec deux études sur les protéines amyloïdes: sur la dynamique résolue dans le temps du lysozyme pendant l’agrégation et sur la dynamique de l’eau d’hydratation de tau lors de la formation de fibres.

Abstract

La diffusion neutronique offre la possibilité de sonder la dynamique dans les échantillons pour une large gamme d’énergies d’une manière non destructive et sans marquage autre que le deutérium. En particulier, la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique enregistre les signaux de diffusion à plusieurs angles de diffusion simultanément et est bien adaptée pour étudier la dynamique des systèmes biologiques sur l’échelle de temps ps-ns. En utilisant des composants tampons D₂O et éventuellement deutérés, la méthode permet de surveiller à la fois la diffusion du centre de masse et les mouvements du squelette et de la chaîne latérale (dynamique interne) des protéines à l’état liquide.

De plus, la dynamique de l’eau d’hydratation peut être étudiée en utilisant des poudres de protéines perdeutérées hydratées avec_H2O. Cet article présente le flux de travail utilisé sur l’instrument IN16B à l’Institut Laue-Langevin (ILL) pour étudier la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation. La préparation d’échantillons de solution et d’échantillons de poudre de protéines hydratées par échange de vapeur est expliquée. La procédure d’analyse des données pour la dynamique des protéines et de l’eau d’hydratation est décrite pour différents types d’ensembles de données (spectres quasi-élastiques ou balayages à fenêtre fixe) qui peuvent être obtenus sur un spectromètre de rétrodiffusion de neutrons.

La méthode est illustrée par deux études portant sur des protéines amyloïdes. L’agrégation du lysozyme en agrégats sphériques de taille μm – notés particules – se produit dans un processus en une étape sur l’espace et la plage temporelle sondés sur IN16B, tandis que la dynamique interne reste inchangée. De plus, la dynamique de l’hydratation de l’eau de tau a été étudiée sur des poudres hydratées de protéines perdeutérées. Il est montré que les mouvements de translation de l’eau sont activés lors de la formation de fibres amyloïdes. Enfin, les étapes critiques du protocole sont discutées quant à la position de la diffusion neutronique par rapport à l’étude de la dynamique par rapport à d’autres méthodes biophysiques expérimentales.

Introduction

Le neutron est une particule massive et sans charge qui a été utilisée avec succès au fil des ans pour sonder des échantillons dans divers domaines allant de la physique fondamentale à la biologie¹. Pour les applications biologiques, la diffusion neutronique aux petits angles, la diffusion inélastique des neutrons, la cristallographie et la réflectométrie neutroniques sont largement utilisées ^2,3,4. La diffusion inélastique des neutrons fournit une mesure de la dynamique en moyenne d’ensemble sans nécessiter de marquage spécifique en soi, et une qualité de signal qui ne dépend pas de la taille ou de la protéine⁵. La mesure peut être effectuée en utilisant un environnement très complexe pour la protéine étudiée qui imite le milieu intracellulaire, comme un lysat bactérien deutéré ou même in vivo ^3,6,7. Différentes configurations expérimentales peuvent être utilisées pour étudier la dynamique, à savoir i) le temps de vol donnant accès à la dynamique sous-ps-ps, ii) l’accès à la rétrodiffusion donnant accès à la dynamique ps-ns, et iii) l’accès spin-echo-donnant accès à la dynamique de ns à des centaines de ns. La rétrodiffusion neutronique utilise la loi de Bragg 2d sinθ = nλ, où d est la distance entre les plans d’un cristal, θ l’angle de diffusion, n l’ordre de diffusion et λ la longueur d’onde. L’utilisation de cristaux pour la rétrodiffusion vers les détecteurs permet d’obtenir une haute résolution en énergie, typiquement ~0,8 μeV. Pour mesurer l’échange d’énergie, soit un entraînement Doppler transportant un cristal en rétrodiffusion est utilisé pour définir et régler la longueur d’onde neutronique entrante ^8,9,10 (Figure 1), soit une configuration de temps de vol peut être utilisée au prix d’une diminution de la résolution d’énergie ¹¹.

Figure 1 : Croquis d’un spectromètre de rétrodiffusion à neutrons avec un entraînement Doppler. Le faisceau entrant frappe le hacheur⁴² de transformation de l’espace de phase (PST), ce qui augmente le flux à la position de l’échantillon. Il est ensuite rétrodiffusé vers l’échantillon par le lecteur Doppler, qui sélectionne une énergie_E1 (flèche cyan). Les neutrons sont ensuite dispersés par l’échantillon (avec différentes énergies représentées par la couleur des flèches) et les analyseurs, constitués de cristaux de Si 111, ne feront que rétrodiffuser des neutrons avec une énergie spécifique E₀ (flèches de couleur rouge ici). Par conséquent, le transfert de quantité de mouvement q est obtenu à partir de la position détectée du neutron sur le réseau de détecteurs, et le transfert d’énergie est obtenu à partir de la différence E₁– E₀. Le temps de vol prévu pour l’impulsion de neutrons produite par le PST est utilisé pour rejeter le signal des neutrons diffusés directement vers les tubes détecteurs. Abréviation : PST = transformation de l’espace de phase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour la spectroscopie de rétrodiffusion, la principale contribution au signal des échantillons riches en protons d’hydrogène, tels que les protéines, provient de la diffusion incohérente, pour laquelle l’intensité de diffusion S_inc(q, ω) est représentée par Eq (1)¹²

(1)

Où σ_inc est la section efficace incohérente de l’élément considéré, k’ est la norme du vecteur d’onde diffusé, k la norme du vecteur d’onde entrant, q (= k – k’) le transfert de quantité de mouvement, r j(t) le vecteur position de l’atome _j au temps t, et ω la fréquence correspondant au transfert d’énergie entre le neutron entrant et le système. Les crochets angulaires indiquent la moyenne de l’ensemble. Par conséquent, la diffusion incohérente sonde l’auto-corrélation d’une seule particule moyenne d’ensemble des positions des atomes avec le temps et donne l’autodynamique moyenne sur tous les atomes du système et différentes origines temporelles (moyenne d’ensemble). La fonction de diffusion est la transformée de Fourier dans le temps de la fonction de diffusion intermédiaire I(q, t), qui peut être vue comme la transformée de Fourier dans l’espace de la fonction de corrélation de van Hove représentée par Eq (2):

(2)

Où ρ(r,t) est la densité de probabilité de trouver un atome à la position r et au temps t ¹³.

Pour un processus de diffusion de Fickian, la fonction d’autodiffusion résulte (voir Eq (3)) après une double transformée de Fourier dans une fonction de diffusion consistant en un Lorentzien de largeur de droite donnée par γ = Dq².

(3)

Des modèles plus sophistiqués ont été développés et jugés utiles, tels que le modèle de diffusion de saut de Singwi et Sjölander pour la dynamique des protéines internes ps-ns¹⁴ ou le modèle de rotation de Sears pour l’eau d’hydratation^15,16,17.

Sur l’instrument de rétrodiffusion de neutrons (NBS) IN16B^8,9 à l’ILL, Grenoble, France (Figure supplémentaire S1), une configuration couramment utilisée avec des protéines est constituée de cristaux de Si 111 pour les analyseurs avec un entraînement Doppler pour régler la longueur d’onde entrante (Figure supplémentaire S2A), donnant ainsi accès à la plage de transfert de quantité de mouvement ~^0,2 Å-1 < q < ~2 ^Å-1 et à la plage de transfert d’énergie de ^–30 μeV < < 30 μeV-correspondant à des échelles de temps allant de quelques ps à quelques ns et des distances de quelques Å. En outre, IN16B offre la possibilité d’effectuer des balayages élastiques et inélastiques à fenêtre fixe (E/IFWS)¹⁰, qui incluent l’acquisition de données lors d’un transfert d’énergie fixe. Comme le flux est limité lorsque l’on travaille avec des neutrons, E/IFWS permet de maximiser le flux pour un transfert d’énergie, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit satisfaisant. Une option plus récente est le spectromètre de rétrodiffusion et de temps de vol (BATS) mode¹¹, qui permet de mesurer une large gamme de transferts d’énergie (par exemple, -150 μeV < < 150 μeV), avec un flux plus élevé qu’avec le lecteur Doppler, mais au prix d’une résolution énergétique inférieure (figure supplémentaire S2B).

Une propriété importante de la diffusion des neutrons est que la section efficace incohérente σ_inc a une valeur 40 fois plus élevée pour l’hydrogène que pour le deutérium et est négligeable pour d’autres éléments couramment trouvés dans les échantillons biologiques. Par conséquent, la dynamique des protéines dans un environnement liquide peut être étudiée en utilisant un tampon deutérisé, et l’état de la poudre permet l’étude soit de la dynamique interne des protéines avec de la poudre de protéine hydrogénée hydratée avec D2O, soit de l’étude de l’eau d’hydratation pour la poudre de protéine perdeutérée hydratée avec_H2O. À l’état liquide, la rétrodiffusion neutronique permet généralement d’accéder simultanément à l’autodiffusion du centre de masse des protéines (diffusion de type fickien) et à leur dynamique interne. Ces derniers sont des mouvements de colonne vertébrale et de chaîne latérale généralement décrits par le modèle dit de diffusion de saut ou d’autres ^3,18. Dans les poudres de protéines hydrogénées, la diffusion des protéines est absente et seule la dynamique interne doit être modélisée. Pour l’eau d’hydratation, les contributions des mouvements translationnels et rotationnels des molécules d’eau présentent une dépendance différente du transfert de quantité de mouvement q, ce qui permet leur distinction dans le processus d’analyse des données¹⁷.

Cet article illustre la méthode de rétrodiffusion des neutrons avec l’étude des protéines qui se sont avérées capables de se déplier, de s’agréger sous une forme canonique composée d’empilements de brins β – le motif dit de β^{croisée 19,20} – et de former des fibres allongées. C’est ce qu’on appelle l’agrégation amyloïde, qui est largement étudiée en raison de son rôle central dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson^21,22. L’étude des protéines amyloïdes est également motivée par le rôle fonctionnel qu’elles peuvent jouer ^23,24 ou leur fort potentiel pour le développement de nouveaux biomatériaux²⁵. Les déterminants physico-chimiques de l’agrégation amyloïde restent flous, et aucune théorie générale de l’agrégation amyloïde n’est disponible, malgré d’énormes progrès au cours des dernières années^21,26.

L’agrégation amyloïde implique des changements dans la structure et la stabilité des protéines avec le temps, dont l’étude implique naturellement une dynamique, liée à la stabilité de la conformation des protéines, à la fonction protéique et au paysage énergétique des protéines²⁷. La dynamique est directement liée à la stabilité d’un état spécifique par la contribution entropique pour les mouvements les plus rapides²⁸, et la fonction protéique peut être maintenue par des mouvements sur différentes échelles de temps de sub-ps pour les protéines sensibles à la lumière²⁹ à ms pour les mouvements de domaine, ce qui peut être facilité par la dynamique picoseconde-nanoseconde³⁰.

Deux exemples d’utilisation de la spectroscopie de rétrodiffusion neutronique pour étudier les protéines amyloïdes seront présentés, l’un à l’état liquide pour étudier la dynamique des protéines et l’autre à l’état de poudre hydratée pour étudier la dynamique de l’hydratation de l’eau. Le premier exemple concerne l’agrégation du lysozyme en sphères de taille μm (appelées particules) suivies en temps réel⁵, et le second une comparaison de la dynamique de l’eau aux états natifs et agrégés de la protéine humaine tau³¹.

Le lysozyme est une enzyme impliquée dans la défense immunitaire et est composé de 129 résidus d’acides aminés. Le lysozyme peut former des particules dans un tampon deutéré à une température de 10,5 et à une température de 90 °C. Avec la diffusion neutronique, nous avons montré que l’évolution temporelle du coefficient de diffusion du centre de masse du lysozyme suit la cinétique exponentielle unique de la fluorescence T de la thioflavine (une sonde fluorescente utilisée pour surveiller la formation de motifs de β croisée amyloïde³²), indiquant que les superstructures particulaires de formation et les modèles de β croisée se produisent en une seule étape avec le même taux. De plus, la dynamique interne est restée constante tout au long du processus d’agrégation, ce qui peut s’expliquer soit par un changement conformationnel rapide qui ne peut être observé sur les instruments NBS, soit par l’absence de changement significatif de l’énergie interne des protéines lors de l’agrégation.

La protéine tau humaine est une protéine intrinsèquement désordonnée (PDI) constituée de 441 acides aminés pour l’isoforme dite 2N4R, qui est notamment impliquée dans la maladie d’Alzheimer³³. En utilisant la rétrodiffusion neutronique sur des poudres de protéine tau perdeutérée, nous avons montré que la dynamique de l’eau d’hydratation est augmentée à l’état fibreux, avec une population plus élevée de molécules d’eau subissant des mouvements de translation. Le résultat suggère qu’une augmentation de l’entropie de l’eau d’hydratation pourrait conduire la fibrillation amyloïde de tau.

Protocol

1. Préparer le tampon deutéré pour les protéines à l’état liquide Dissoudre tous les composants du tampon dans duD2Opur. Si l’électrode de pH a été étalonnée enH2O, ajuster le selon la formule = pH + 0,4 en utilisant NaOD ou DCl34.REMARQUE : L’utilisation deD 2 O au lieu de H2O pourrait avoir une incidence sur la solubilité des protéines et il pourrait être nécessaire d’adapter les condition…

Representative Results

L’agrégation du lysozyme en particules a été réalisée à 90 °C avec une concentration protéique de 50 mg/mL dans un tampon deutéré (0,1 M NaCl à 10,5). La formation de particules est déclenchée par l’augmentation de la température jusqu’à 90 °C et se produit dans les 6 heures (figure supplémentaire S8). L’acquisition des données a été effectuée sur IN16B, comme décrit dans le protocole ci-dessus (les données sont conservées en permanence par le PEB et accessibles au http://…

Discussion

La spectroscopie neutronique est la seule méthode qui permet de sonder la dynamique ps-ns moyenne d’ensemble des échantillons de protéines, quelle que soit la taille de la protéine ou la complexité de la solution lorsque la deutération est utilisée⁶. Plus précisément, en sondant l’autodiffusion d’assemblages protéiques en solution, la taille hydrodynamique de ces assemblages peut être déterminée sans ambiguïté. Néanmoins, la méthode est généralement limitée par le faible …

Materials

Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072