ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

Summary

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

Abstract

פיזור נייטרונים מציע את האפשרות לחקור את הדינמיקה בתוך הדגימות עבור מגוון רחב של אנרגיות באופן לא הרסני וללא תיוג מלבד דאוטריום. בפרט, ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מתעדת את אותות הפיזור במספר זוויות פיזור בו זמנית ומתאימה היטב לחקר הדינמיקה של מערכות ביולוגיות בסקאלת הזמן ps-ns. על ידי שימוש ברכיבי D₂O – ואולי גם רכיבי חיץ מפורקים – השיטה מאפשרת ניטור הן של דיפוזיה של מרכז המסה והן של תנועות עמוד השדרה והשרשרת הצידית (דינמיקה פנימית) של חלבונים במצב נוזלי.

בנוסף, ניתן לחקור את דינמיקת מי ההידרציה על ידי שימוש באבקות של חלבונים מחוררים עם H₂O. מאמר זה מציג את תהליך העבודה שהופעל במכשיר IN16B במכון Laue-Langevin (ILL) כדי לחקור דינמיקה של חלבונים ומי הידרציה. הכנת דגימות תמיסה ודגימות אבקת חלבון hydrated באמצעות חילופי אדים מוסבר. הליך ניתוח הנתונים עבור דינמיקת מים של חלבונים והידרציה מתואר עבור סוגים שונים של מערכי נתונים (ספקטרום קוואזיאלסטי או סריקות חלונות קבועים) שניתן לקבל על ספקטרומטר פיזור אחורי של נייטרונים.

השיטה מודגמת באמצעות שני מחקרים שכללו חלבוני עמילואיד. הצבירה של ליזוזים לצברים כדוריים בגודל מיקרומטר – חלקיקים מסומנים – מתרחשת בתהליך בן שלב אחד על טווח המרחב והזמן שנבחן על IN16B, בעוד שהדינמיקה הפנימית נותרת ללא שינוי. יתר על כן, הדינמיקה של מי הידרציה של טאו נחקרה על אבקות לחות של חלבון perdeuterated. זה מראה כי תנועות תרגום של מים מופעלות על היווצרות של סיבי עמילואיד. לבסוף, נדונים צעדים קריטיים בפרוטוקול לגבי האופן שבו פיזור נייטרונים ממוקם ביחס לחקר הדינמיקה ביחס לשיטות ביופיזיקליות ניסיוניות אחרות.

Introduction

הנייטרון הוא חלקיק מסיבי וחסר מטען ששימש בהצלחה לאורך השנים לבדיקת דגימות בתחומים שונים, מפיזיקה בסיסית ועד ביולוגיה¹. עבור יישומים ביולוגיים, פיזור נייטרונים בזווית קטנה, פיזור נייטרונים בלתי אלסטי, קריסטלוגרפיה ורפלקטומטריה של נייטרונים נמצאים בשימוש נרחב ^2,3,4. פיזור נייטרונים קשיח מספק מדידה ממוצעת של הדינמיקה ללא צורך בתיוג ספציפי כשלעצמו, ואיכות אות שאינה תלויה בגודל או בחלבון⁵. המדידה יכולה להיעשות באמצעות סביבה מורכבת מאוד עבור החלבון הנחקר המחקה את התווך התוך-תאי, כגון ליזט חיידקי או אפילו in vivo ^3,6,7. ניתן להשתמש במערכי ניסוי שונים כדי לחקור את הדינמיקה, כלומר i) גישה של זמן טיסה לדינמיקות sub-ps-ps, ii) גישה המעניקה פיזור לאחור לדינמיקות ps-ns, ו-iii) גישה נותנת ספין-הד לדינמיקה מ-ns למאות ns. פיזור אחורי של נייטרונים עושה שימוש בחוק בראג 2d sinθ = nλ, כאשר d הוא המרחק בין מישורים בגביש, θ זווית הפיזור, n סדר הפיזור ו-λ אורך הגל. השימוש בגבישים לפיזור לאחור לכיוון הגלאים מאפשר השגת רזולוציה גבוהה באנרגיה, בדרך כלל ~0.8 μeV. כדי למדוד את חילופי האנרגיה, משתמשים בכונן דופלר הנושא גביש בפיזור לאחור כדי להגדיר ולכוונן את אורך גל הנייטרונים הנכנס ^8,9,10 (איור 1), או שניתן להשתמש במערך זמן טיסה במחיר של ירידה ברזולוציית האנרגיה ¹¹.

איור 1: שרטוט של ספקטרומטר פיזור לאחור של נייטרונים עם כונן דופלר. הקרן הנכנסת פוגעת במסוק טרנספורמציית חלל הפאזה (PST)⁴², המגדיל את השטף במיקום הדגימה. לאחר מכן הוא מפוזר לאחור לכיוון הדגימה על ידי כונן דופלר, אשר בוחר אנרגיה E₁ (חץ ציאן). לאחר מכן הנייטרונים מפוזרים על ידי הדגימה (עם אנרגיות שונות המיוצגות על ידי צבע החיצים) והאנלייזרים, העשויים מגבישי Si 111, יפזרו לאחור נייטרונים רק עם אנרגיה ספציפית E₀ (חיצים בצבע אדום כאן). לפיכך, העברת התנע q מתקבלת מהמיקום שזוהה של הנייטרון על מערך הגלאים, והעברת האנרגיה מתקבלת מההפרש E₁– E₀. זמן הטיסה הצפוי לפעימת הנייטרונים המופקת על ידי ה-PST משמש להשלכת האות מהנייטרונים המפוזרים ישירות לעבר צינורות הגלאי. קיצור: PST = טרנספורמציה של מרחב פאזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עבור ספקטרוסקופיית פיזור לאחור, התרומה העיקרית לאות מדגימות עשירות בפרוטוני מימן, כגון חלבונים, מגיעה מפיזור לא קוהרנטי, שעבורו עוצמת הפיזור S_inc(q, ω) מוצגת על ידי Eq (1)¹²

(1)

כאשר σ_inc הוא חתך הרוחב הלא קוהרנטי של היסוד הנחשב, k’ הוא הנורמה של וקטור הגל המפוזר, k הנורמה של וקטור הגל הנכנס, q (= k – k’) העברת התנע, r j(t) וקטור המיקום של אטום _j בזמן t, ו-ω התדר המתאים למעבר האנרגיה בין הנייטרון הנכנס למערכת. הסוגריים הזוויתיים מציינים את ממוצע ההרכב. לפיכך, פיזור לא קוהרנטי בוחן את המתאם העצמי הממוצע של חלקיק בודד של מיקומי אטומים עם זמן ונותן את הדינמיקה העצמית הממוצעת על פני כל האטומים במערכת ומקורות זמן שונים (ממוצע אנסמבל). פונקציית הפיזור היא התמרת פורייה בזמן של פונקציית פיזור הביניים I(q, t), שניתן לראותה כהתמרת פורייה במרחב של פונקציית מתאם ואן הוב המוצגת על ידי Eq (2):

(2)

כאשר ρ(r,t) היא צפיפות ההסתברות למציאת אטום במיקום r ובזמן t ¹³.

עבור תהליך דיפוזיה פיקיאנית, פונקציית הדיפוזיה העצמית נוצרת (ראו Eq (3)) לאחר התמרת פורייה כפולה בפונקציית פיזור המורכבת מלורנציאן של רוחב קו הנתון על ידי γ = Dq².

(3)

מודלים מתוחכמים יותר פותחו ונמצאו שימושיים כגון מודל דיפוזיית הקפיצה על ידי Singwi ו- Sjölander עבור ps-ns דינמיקה פנימית של חלבונים¹⁴ או מודל הסיבוב על ידי סירס עבור מי הידרציה^15,16,17.

במכשיר פיזור אחורי של נייטרונים (NBS) IN16B^8,9 ב-ILL, גרנובל^, צרפת (איור משלים S1), מערך נפוץ עם חלבונים מורכב מגבישי Si 111 עבור האנלייזרים עם כונן דופלר לכוונון אורך הגל הנכנס (איור משלים S2A), ובכך נותן גישה לטווח העברת התנע ~0.2 Å-1 < q < ~2 ^Å-1 וטווח העברת אנרגיה של ^–30 μeV < < 30 μeV – מתאים לטווחי זמן הנעים בין כמה ps לכמה ns ומרחקים של כמה Å. בנוסף, IN16B מציע את האפשרות לבצע סריקות גמישות ובלתי אלסטיות של חלונות קבועים (E/IFWS)¹⁰, הכוללות איסוף נתונים בהעברת אנרגיה קבועה. מכיוון שהשטף מוגבל בעבודה עם נייטרונים, E/IFWS מאפשר למקסם את השטף להעברת אנרגיה אחת, ובכך מקצר את זמן הרכישה הדרוש לקבלת יחס אות לרעש מספק. אפשרות עדכנית יותר היא מצב ספקטרומטר פיזור לאחור וזמן טיסה (BATS)¹¹, המאפשר מדידה של מגוון רחב של העברות אנרגיה, (למשל, -150 μeV < < 150 μeV), עם שטף גבוה יותר מאשר עם כונן דופלר, אך במחיר של רזולוציית אנרגיה נמוכה יותר (איור משלים S2B).

תכונה חשובה של פיזור נייטרונים היא שחתך הרוחב הלא קוהרנטי σ_inc הוא בעל ערך גבוה פי 40 עבור מימן מאשר עבור דאוטריום, והוא זניח עבור יסודות אחרים הנמצאים בדרך כלל בדגימות ביולוגיות. לכן, ניתן לחקור את הדינמיקה של חלבונים בסביבה נוזלית באמצעות מאגר deuterated, ומצב האבקה מאפשר לחקור דינמיקה פנימית של חלבונים עם אבקת חלבון מוקשה hydrated עם D 2 O, או המחקר של מים הידרציה עבוראבקת חלבון perdeuterated hydrated עם H₂O. במצב נוזלי, פיזור אחורי של נייטרונים מאפשר בדרך כלל גישה בו זמנית לדיפוזיה העצמית של מרכז המסה של חלבונים (דיפוזיה מסוג פיקיאן) ולדינמיקה הפנימית שלהם. אלה האחרונים הם תנועות עמוד השדרה ושרשרת הצד המתוארות בדרך כלל על ידי מה שנקרא מודל דיפוזיה קפיצה או אחרים ^3,18. באבקות חלבון מוקשה, דיפוזיית החלבון נעדרת ויש למדל רק דינמיקה פנימית. עבור מי הידרציה, התרומות של תנועות תרגומיות וסיבוביות של מולקולות מים מציגות תלות שונה בהעברת התנע q, המאפשרת את ההבחנה ביניהן בתהליך ניתוח הנתונים¹⁷.

מאמר זה מדגים את שיטת הפיזור לאחור של נייטרונים באמצעות מחקר של חלבונים שנמצאו מסוגלים להתפתח, להצטבר לצורה קנונית המורכבת מערימות של β-גדילים – מה שמכונה תבנית β צולבת^19,20 – וליצור סיבים מוארכים. זהו מה שנקרא צבירה עמילואיד, אשר נחקר בהרחבה בשל תפקידו המרכזי בהפרעות נוירודגנרטיביות כגון אלצהיימר או פרקינסון^21,22. המחקר של חלבוני העמילואיד מונע גם על ידי התפקיד הפונקציונלי שהם יכולים למלא ^23,24 או הפוטנציאל הגבוה שלהם לפיתוח ביו-חומרים חדשים²⁵. הדטרמיננטים הפיזיקוכימיים של צבירת העמילואיד עדיין אינם ברורים, ואין תיאוריה כללית של צבירת עמילואיד, למרות התקדמות עצומה במהלך השנים האחרונות^21,26.

צבירת עמילואיד מרמזת על שינויים במבנה החלבון וביציבותו עם הזמן, שהמחקר שלהם מרמז באופן טבעי על דינמיקה, הקשורה ליציבות קונפורמציה של חלבונים, תפקוד חלבונים ונוף אנרגיית חלבון²⁷. דינמיקה קשורה ישירות ליציבות של מצב מסוים באמצעות התרומה האנטרופית עבור התנועות המהירות ביותר²⁸, ותפקוד החלבונים יכול להתקיים על ידי תנועות בסקאלות זמן שונות, החל מ-sub-ps עבור חלבונים רגישים לאור²⁹ ועד ms עבור תנועות תחום, אשר ניתן להקל על ידי דינמיקה פיקו-שנייה-ננו-שנייה³⁰.

יוצגו שתי דוגמאות לשימוש בספקטרוסקופיית פיזור לאחור של נייטרונים לחקר חלבוני עמילואיד, אחת במצב נוזלי לחקר דינמיקה של חלבונים ואחת במצב אבקה רוויית לחות לחקר דינמיקת מי הידרציה. הדוגמה הראשונה נוגעת לצבירה של ליזוזים לכדורים בגודל מיקרומטר (הנקראים חלקיקים) ואחריה בזמן אמת⁵, והשנייה השוואה של דינמיקת מים במצבים טבעיים ומצטברים של החלבון האנושי טאו³¹.

ליזוזים הוא אנזים המעורב בהגנה החיסונית ומורכב משאריות של 129 חומצות אמינו. ליזוזים יכול ליצור חלקיקים בחיץ מפורק ב pD של 10.5 ובטמפרטורה של 90 ° C. עם פיזור נייטרונים, הראינו כי התפתחות הזמן של מקדם הדיפוזיה של מרכז המסה של ליזוזים עוקבת אחר הקינטיקה המעריכית היחידה של תיאופלבין T פלואורסצנטי (בדיקה פלואורסצנטית המשמשת לניטור היווצרות תבניות β צולבות עמילואיד³²), מה שמצביע על כך שהיווצרות מבני על חלקיקיים ותבניות β צולבות מתרחשות בשלב אחד עם אותו קצב. יתר על כן, הדינמיקה הפנימית נשארה קבועה לאורך כל תהליך הצבירה, אשר ניתן להסביר או על ידי שינוי קונפורמציה מהיר שלא ניתן לצפות בו על מכשירי NBS, או על ידי היעדר שינוי משמעותי באנרגיה הפנימית של החלבונים בעת הצבירה.

החלבון האנושי טאו הוא חלבון בעל הפרעה מהותית (IDP) המורכב מ-441 חומצות אמינו עבור מה שמכונה איזופורם 2N4R, אשר מעורב באופן בולט במחלת אלצהיימר³³. באמצעות פיזור לאחור של נייטרונים על אבקות של חלבון טאו מפורר, הראינו כי דינמיקת מי הידרציה מוגברת במצב הסיבים, כאשר אוכלוסייה גבוהה יותר של מולקולות מים עוברות תנועות תרגומיות. התוצאה מצביעה על כך שעלייה באנטרופיית מי הידרציה עשויה להניע את פרפור העמילואיד של טאו.

Protocol

1. הכינו את החיץ המנוטרל לחלבונים במצב נוזלי ממיסים את כל רכיבי המאגר ב-D2O טהור. אם אלקטרודת ה- pH כוילתה ב- H2O, התאם את ה- pD בהתאם לנוסחה pD = pH + 0.4 באמצעות NaOD או DCl34.הערה: השימוש ב-D 2O במקום ב-H2O עשוי להשפיע על מסיסות החלבון, וייתכן שיהיה צור?…

Representative Results

הצבירה של ליזוזים לחלקיקים בוצעה ב 90 ° C עם ריכוז חלבון של 50 מ”ג / מ”ל בחיץ deuterated (0.1 M NaCl ב pD 10.5). היווצרות חלקיקים מופעלת על-ידי עליית הטמפרטורה ל-90°C ומתרחשת תוך 6 שעות (איור משלים S8). איסוף הנתונים בוצע ב-IN16B, כמתואר בפרוטוקול לעיל (הנתונים נאספים לצמיתות על ידי ה-ILL ונגישים ב-http://dx.doi.org/10….

Discussion

ספקטרוסקופיית נויטרונים היא השיטה היחידה המאפשרת לחקור את הדינמיקה הממוצעת של ps-ns של דגימות חלבון, ללא קשר לגודל החלבון או למורכבות התמיסה כאשר משתמשים בדאוטרציה⁶. באופן ספציפי, על ידי בדיקת דיפוזיה עצמית של מכלולי חלבונים בתמיסה, ניתן לקבוע באופן חד משמעי את הגודל ההידרודינ?…

Materials

Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072