Högupplöst neutronspektroskopi för att studera pikosekund-nanosekunddynamik hos proteiner och hydratiseringsvatten

Summary

Neutronbackspridningsspektroskopi erbjuder en icke-destruktiv och etikettfri tillgång till ps-ns-dynamiken hos proteiner och deras hydratiseringsvatten. Arbetsflödet presenteras med två studier på amyloidproteiner: på den tidsupplösta dynamiken av lysozym under aggregering och på hydratiseringsvattendynamiken hos tau vid fiberbildning.

Abstract

Neutronspridning erbjuder möjligheten att undersöka dynamiken i prover för ett brett spektrum av energier på ett icke-destruktivt sätt och utan annan märkning än deuterium. I synnerhet registrerar neutronspridningsspektroskopi spridningssignalerna vid flera spridningsvinklar samtidigt och är väl lämpad för att studera dynamiken i biologiska system på ps-ns tidsskala. Genom att använda D₂O-och eventuellt deutererade buffertkomponenter möjliggör metoden övervakning av både masscentrumdiffusion och ryggrads- och sidokedjerörelser (inre dynamik) hos proteiner i flytande tillstånd.

Dessutom kan hydratiseringsvattendynamik studeras genom att använda pulver av perdeutererade proteiner hydratiserade med_H2O. Denna uppsats presenterar arbetsflödet som används på instrumentet IN16B vid Institut Laue-Langevin (ILL) för att undersöka protein- och hydratiseringsvattendynamik. Beredningen av lösningsprover och hydratiserade proteinpulverprover med ångutbyte förklaras. Dataanalysproceduren för både protein- och hydratiseringsvattendynamik beskrivs för olika typer av dataset (kvasielastiska spektra eller fasta fönsterskanningar) som kan erhållas på en neutronspridningsspektrometer.

Metoden illustreras med två studier med amyloidproteiner. Aggregeringen av lysozym i sfäriska aggregat av μm-storlek – betecknade partiklar – visas ske i en enstegsprocess på rymd- och tidsintervallet som sonderas på IN16B, medan den interna dynamiken förblir oförändrad. Vidare studerades dynamiken hos hydratiseringsvatten av tau på hydratiserade pulver av perdeuterat protein. Det visas att translationella rörelser av vatten aktiveras vid bildandet av amyloidfibrer. Slutligen diskuteras kritiska steg i protokollet för hur neutronspridning positioneras när det gäller studier av dynamik med avseende på andra experimentella biofysiska metoder.

Introduction

Neutronen är en laddningsfri och massiv partikel som framgångsrikt har använts genom åren för att undersöka prover inom olika områden från grundläggande fysik till biologi¹. För biologiska tillämpningar används neutronspridning med liten vinkel, inelastisk neutronspridning och neutronkristallografi och reflektometri i stor utsträckning ^2,3,4. Inelastisk neutronspridning ger en ensemble-medelvärdesmätning av dynamiken utan att kräva specifik märkning i sig, och en signalkvalitet som inte beror på storleken eller proteinet⁵. Mätningen kan göras med hjälp av en mycket komplex miljö för proteinet som studeras som efterliknar det intracellulära mediet, såsom ett deutererat bakteriellt lysat eller till och med in vivo ^3,6,7. Olika experimentella uppställningar kan användas för att studera dynamiken, nämligen i) time-of-flight-giving access to sub-ps-ps dynamics, ii) backscattering-giving access to ps-ns dynamics, och iii) spin-echo-giving access to dynamics from ns to hundreds ns. Neutronåterspridning använder Braggs lag 2d sinθ = nλ, där d är avståndet mellan plan i en kristall, θ spridningsvinkeln, n spridningsordningen och λ våglängden. Användningen av kristaller för bakåtspridning mot detektorerna möjliggör en hög upplösning i energi, typiskt ~ 0,8 μeV. För att mäta energiutbytet används antingen en dopplerdrivenhet som bär en kristall i backscattering för att definiera och ställa in den inkommande neutronvåglängden ^8,9,10 (figur 1), eller en flygtidsinställning kan användas på bekostnad av en minskning av energiupplösningen ¹¹.

Figur 1: Skiss av en neutronspridningsspektrometer med dopplerdrift. Den inkommande strålen träffar fasrumstransformationen (PST) chopper⁴², vilket ökar flödet vid provpositionen. Den sprids sedan bakåt mot provet av dopplerdrivningen, som väljer en energi E₁ (cyanpil). Neutronerna sprids sedan av provet (med olika energier representerade av pilarnas färg) och analysatorerna, gjorda av Si 111-kristaller, kommer bara att sprida neutroner med en specifik energi E₀ (rödfärgade pilar här). Därför erhålls momentöverföringen q från neutronens detekterade position på detektormatrisen och energiöverföringen erhålls från skillnaden E₁– E₀. Den flygtid som förväntas för neutronpulsen som produceras av PST används för att kassera signalen från neutronerna spridda direkt mot detektorrören. Förkortning: PST = fasrymdtransformation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För backscatteringspektroskopi kommer det huvudsakliga bidraget till signalen från väteprotonrika prover, såsom proteiner, från inkoherent spridning, för vilken spridningsintensiteten S_inc (q, ω) visas av Eq (1) ¹²

(1)

Där_{σ inc} är det osammanhängande tvärsnittet av det element som beaktas, är k’ normen för den spridda vågvektorn, k normen för den inkommande vågvektorn, q (= k – k’) momentöverföringen, r j (t) positionsvektorn för atom _j vid tiden t och ω frekvensen som motsvarar energiöverföringen mellan den inkommande neutronen och systemet. Vinkelparenteserna anger ensemblemedelvärdet. Därför undersöker inkoherent spridning ensemblemedelvärdet av enpartikels självkorrelation av atompositioner med tiden och ger självdynamiken i genomsnitt över alla atomer i systemet och olika tidsursprung (ensemblemedelvärde). Spridningsfunktionen är Fouriertransformen i tiden av den mellanliggande spridningsfunktionen I(q, t), som kan ses som Fouriertransformen i rummet av van Hove-korrelationsfunktionen som visas av Eq (2):

(2)

Där ρ(r,t) är sannolikhetstätheten för att hitta en atom vid position r och tiden t ¹³.

För en fickiansk diffusionsprocess resulterar självdiffusionsfunktionen (se Eq (3)) efter en dubbel Fouriertransform i en spridningsfunktion bestående av en Lorentzian med linjebredd given av γ = Dq².

(3)

Mer sofistikerade modeller utvecklades och befanns användbara såsom hoppdiffusionsmodellen av Singwi och Sjölander för ps-ns interna proteindynamik¹⁴ eller rotationsmodellen av Sears för hydratiseringsvatten^15,16,17.

På neutronspridningsinstrumentet IN16B ^8,9 vid ILL, Grenoble, Frankrike (kompletterande figur S1) består en inställning som vanligtvis används med proteiner av Si 111-kristaller för analysatorerna med en dopplerdrivning för att ställa in den inkommande våglängden (kompletterande figur S2A), vilket ger tillgång till momentöverföringsområdet ~ ^0,2 Å-1 < q < ~ 2 ^Å-1 och energiöverföringsområdet ^–30 μeV < < 30 μeV motsvarande tidsskalor från några ps till några ns och avstånd på några Å. Dessutom erbjuder IN16B möjligheten att utföra elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster (E/IFWS)¹⁰, vilket inkluderar datainsamling vid en fast energiöverföring. Eftersom flödet är begränsat vid arbete med neutroner möjliggör E/IFWS maximering av flödet för en energiöverföring, vilket minskar förvärvstiden som behövs för att uppnå ett tillfredsställande signal-brusförhållande. Ett nyare alternativ är backscattering och time-of-flight spectrometer (BATS) mode¹¹, som möjliggör mätning av ett brett spektrum av energiöverföringar, (t.ex. -150 μeV < < 150 μeV), med ett högre flöde än med dopplerdriften, men på bekostnad av en lägre energiupplösning (kompletterande figur S2B).

En viktig egenskap hos neutronspridning är att det inkoherenta tvärsnittet σ_inc har ett 40 gånger högre värde för väte än för deuterium och är försumbar för andra element som vanligtvis finns i biologiska prover. Därför kan dynamiken hos proteiner i en flytande miljö studeras med hjälp av en deutererad buffert, och pulvertillståndet möjliggör studier av antingen proteinets inre dynamik med hydrerat proteinpulver hydratiserat med D2O, eller studien av hydratiseringsvatten för perdeutererat proteinpulver hydratiserat med_H2O. I flytande tillstånd tillåter neutronåterspridning typiskt samtidig åtkomst till masscentrets självdiffusion av proteiner (diffusion av fickian-typ) och deras interna dynamik. De senare är ryggrads- och sidokedjerörelser som vanligtvis beskrivs av den så kallade hoppdiffusionsmodellen eller andra ^3,18. I hydrerade proteinpulver saknas proteindiffusionen och endast intern dynamik behöver modelleras. För hydratiseringsvatten uppvisar bidragen från translationella och roterande rörelser av vattenmolekyler ett annat beroende av momentöverföringen q, vilket möjliggör deras distinktion i dataanalysprocessen¹⁷.

Denna artikel illustrerar neutronspridningsmetoden med studier av proteiner som visade sig kunna utvecklas, aggregera till en kanonisk form bestående av staplar av β-strängar – det så kallade kors-β mönstret^19,20 – och bilda långsträckta fibrer. Detta är den så kallade amyloidaggregeringen, som studeras omfattande på grund av dess centrala roll i neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers eller Parkinsons sjukdomar^21,22. Studien av amyloidproteinerna motiveras också av den funktionella roll de kan spela ^23,24 eller deras höga potential för utveckling av nya biomaterial²⁵. De fysikalisk-kemiska determinanterna för amyloidaggregeringen är fortfarande oklara, och ingen allmän teori om amyloidaggregering finns tillgänglig, trots enorma framsteg under de senaste åren^21,26.

Amyloidaggregering innebär förändringar i proteinstruktur och stabilitet med tiden, vars studie naturligtvis innebär dynamik, kopplad till proteinkonformationsstabilitet, proteinfunktion och proteinenergilandskap²⁷. Dynamik är direkt kopplad till stabiliteten hos ett specifikt tillstånd genom det entropiska bidraget för de snabbaste rörelserna²⁸, och proteinfunktionen kan upprätthållas av rörelser på olika tidsskalor från sub-ps för ljuskänsliga proteiner²⁹ till ms för domänrörelser, vilket kan underlättas av picosecond-nanosecond dynamics³⁰.

Två exempel på att använda neutronbackspridningsspektroskopi för att studera amyloidproteiner kommer att presenteras, ett i flytande tillstånd för att studera proteindynamik och ett i hydratiserat pulvertillstånd för att studera hydratiseringsvattendynamik. Det första exemplet gäller aggregering av lysozym i μm-sfärer (kallade partiklar) följt i realtid⁵, och det andra en jämförelse av vattendynamik i naturliga och aggregerade tillstånd av det humana proteinet tau³¹.

Lysozym är ett enzym som är involverat i immunförsvaret och består av 129 aminosyrarester. Lysozym kan bilda partiklar i deutererad buffert vid pD 10,5 och vid en temperatur på 90 °C. Med neutronspridning visade vi att tidsutvecklingen av massdiffusionskoefficienten för lysozym följer den enda exponentiella kinetiken för tioflavin T-fluorescens (en fluorescerande sond som används för att övervaka bildandet av amyloidkors-β mönster³²), vilket indikerar att bildningspartikelformiga överbyggnader och kors-β mönster förekommer i ett enda steg med samma hastighet. Dessutom förblev den interna dynamiken konstant under hela aggregeringsprocessen, vilket kan förklaras antingen av en snabb konformationsförändring som inte kan observeras på NBS-instrument eller av frånvaron av signifikant förändring i proteinets interna energi vid aggregering.

Det humana proteinet tau är ett egenstört protein (IDP) som består av 441 aminosyror för den så kallade 2N4R-isoformen, som är särskilt involverad i Alzheimers sjukdom³³. Med hjälp av neutronåterspridning på pulver av perdeutererat protein tau visade vi att hydratiseringsvattendynamiken ökar i fibertillståndet, med en högre population av vattenmolekyler som genomgår translationella rörelser. Resultatet tyder på att en ökning av hydreringsvattenentropi kan driva amyloidflimmer av tau.

Protocol

1. Förbered den deutererade bufferten för proteiner i flytande tillstånd Lös upp alla buffertkomponenter i renD2O. Om pH-elektroden kalibrerades iH2O, justera pD enligt formeln pD = pH + 0,4 med NaOD eller DCl34.OBS: Användningen av D2O i stället förH2Okan påverkaproteinlösligheten och buffertförhållandena kan behöva anpassas (t.ex. genom en liten förändring av saltkoncentrationen). <p clas…

Representative Results

Aggregeringen av lysozym till partiklar utfördes vid 90 °C med en proteinkoncentration på 50 mg/ml i en deutererad buffert (0,1 M NaCl vid pD 10,5). Partikelbildningen utlöses av temperaturökningen till 90 °C och sker inom 6 timmar (kompletterande figur S8). Datainsamlingen utfördes på IN16B, som beskrivs i protokollet ovan (data är permanent kuraterade av ILL och tillgängliga vid http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811). Ett QENS-spektrum förvärvades vid 7 °C…

Discussion

Neutronspektroskopi är den enda metoden som gör det möjligt att undersöka den ensemble-genomsnittliga ps-ns-dynamiken hos proteinprover oavsett proteinets storlek eller lösningens komplexitet när deuteration används⁶. Specifikt, genom att undersöka självdiffusion av proteinaggregat i lösning, kan den hydrodynamiska storleken hos sådana sammansättningar entydigt bestämmas. Icke desto mindre begränsas metoden vanligen av det låga neutronflödet, vilket innebär långa förvärvstider …

Materials

Aluminum sample holder			Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide (D, 99.9%)	Eurisotop	DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease	Sigma-Aldrich	Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur	Sigma-Aldrich	1.5901
Glass dessicator	VWR	75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm	VWR	89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999%	Alfa Aesar	00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg	Sigma-Aldrich	62970
nPDyn		v3.x	see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration	Dutscher	92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99%	Sigma-Aldrich	214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL	Starlab	S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL	Starlab	S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL	Starlab	S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL	Starlab	S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL	Starlab	S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL	Starlab	S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D	Sigma-Aldrich	372072