Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.
Abstract
Das Verständnis der Proteinhomöostase in vivo ist der Schlüssel zum Wissen, wie die Zellen sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen funktionieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt die In-vivo-Markierung und anschließende Reinigung neu synthetisierter Proteine unter Verwendung einer manipulierten Mauslinie, um die Proteinmarkierung an bestimmte Zellpopulationen zu richten. Es handelt sich um eine induzierbare Linie durch Cre-Rekombinase-Expression der L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die einen Einbau von Azidonorleucin (ANL) in die Proteine ermöglicht, der sonst nicht auftritt. Mit der hier beschriebenen Methode ist es möglich, zelltypspezifische Proteome, die in vivo markiert sind, zu reinigen und subtile Veränderungen des Proteingehalts aufgrund der Reduktion der Probenkomplexität zu erkennen.
Introduction
Aberrante Proteinhomöostase wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Mehrere Krankheiten stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der Proteinhomöostase. Das Kennzeichen einiger Krankheiten ist das Vorhandensein von Aggregaten an verschiedenen subzellulären Orten und Gehirnbereichen. Die Proteinhomöostase ist nicht nur bei Krankheiten wichtig, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei der normalen Organ- und Zellfunktion1. Zum Beispiel ist die Proteinsynthese für viele Formen der neuronalen Plastizitätnotwendig 2,3, wie durch die Verwendung chemischer Inhibitoren bestimmt, die die Proteinsynthese blockieren4. Es ist jedoch weder klar, bei welchen Zelltypen das Proteom verändert wird, um Lernen und Gedächtnis zu unterstützen, noch ist bekannt, welche spezifischen Proteine in jedem Zelltyp ihre Synthese oder ihren Abbau erhöhen oder verringern. Daher erfordert eine umfassende Untersuchung der Proteinhomöostase die Fähigkeit, Proteome aus bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Tatsächlich war die Identifizierung zelltypspezifischer Proteome zur Untersuchung zellulärer Prozesse, die in einer mehrzelligen Umgebung ablaufen, eine wichtige Hürde in der Proteomik. Aus diesem Grund haben wir eine Technik entwickelt, die MetRS*-Expression in Kombination mit bioorthogonalen Methoden verwendet, die sich als effektiver Weg zur Identifizierung und Reinigung zelltypspezifischer Proteome erwiesen hat und diese Lücke füllt 5,6,7.
Die Expression eines mutierten MetRS* (MetRS L274G) ermöglicht das Laden des nicht-kanonischen Methionin-Analogons ANL in die entsprechende tRNA 8,9 und dessen anschließenden Einbau in Proteine. Wenn die MetRS*-Expression durch einen zelltypspezifischen Promotor reguliert wird, wird die nicht-kanonische Aminosäure zellselektiv in die Proteine eingebaut. Sobald ANL in die Proteine eingebaut ist, kann es selektiv durch Klickchemie funktionalisiert und anschließend entweder durch Bildgebung (FUNCAT) oder durch Western Immunoblot (BONCAT) sichtbar gemacht werden. Alternativ können Proteine selektiv gereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Mit dieser Technologie haben wir eine Mauslinie erstellt, die das MetRS*-Protein unter der Kontrolle der Cre-Rekombinase exprimiert. Angesichts der steigenden Anzahl verfügbarer Cre-Maus-Linien kann das MetRS*-System in jedem Bereich verwendet werden, um jeden Zelltyp aus jedem Gewebe zu untersuchen, für das es eine bestehende Cre-Linie gibt. Die Proteinmarkierung mit ANL ist in vitro oder in vivo möglich und verändert weder das Verhalten der Maus noch die Proteinintegrität6. Die Markierungszeit kann an die wissenschaftliche Fragestellung jedes Forschers angepasst werden, indem neu synthetisierte Proteine (kürzere Markierungszeiten) oder ganze Proteome (längere Markierungszeiten) markiert werden. Die Verwendung dieser Technik ist durch die Anzahl der Zellen des Typs begrenzt, den der Forscher zu untersuchen bereit ist; Daher ist eine Proteinisolierung aus Zelltypen mit geringer Anzahl oder niedrigen Stoffwechselraten mit dieser Methode nicht möglich. Ziel der vorgestellten Methode ist es, zelltypspezifische Proteine/Proteome zu identifizieren, die in vivo markiert sind. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zelltypspezifische Proteome mit ANL in lebenden Mäusen markiert und die markierten Proteine gereinigt werden. Nach der Reinigung können Proteine durch routinemäßige Massenspektrometrieprotokolle 5,10 identifiziert werden. Die Reduzierung der Probenkomplexität, die bei dieser Methode durch die selektive Reinigung von Proteinen aus bestimmten Zellpopulationen erreicht wird, ermöglicht es dem Experimentator, subtile Veränderungen in Proteomen zu erkennen, beispielsweise als Reaktion auf Umweltveränderungen. Die Reinigung der markierten Proteine kann in ~10 Tagen erreicht werden, ohne die MS-Analyse oder die Markierungsperiode. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur ANL-Verabreichung an MetRS*-exprimierende Mäuse, nämlich (1) Zugabe der Aminosäure im Trinkwasser und (2) Einführung von ANL durch intraperitoneale Injektionen. Unabhängig von der für die ANL-Verabreichung gewählten Methode sind die Isolations- und Reinigungsschritte die gleichen (ab Schritt 2).
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Protocol
Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der lokalen Regierungsstellen in Deutschland (RP Darmstadt; Protokolle: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) oder Spanien (Ausschuss für Tierversuche an der UCM und Umweltberatung der Comunidad de Madrid, Protokollnummer: PROEX 005.0/21) durchgeführt und entsprechen den Regeln der Max-Planck-Gesellschaft und den spanischen Vorschriften sowie den EU-Richtlinien für den Tierschutz.
1. In vivo metabolische Markierung mit ANL
- Trinkwasser:
- Lösen Sie ANL und Maltose im normalen Trinkwasser der Mäuse auf. Die empfohlene Maltosekonzentration beträgt 0,7% (Gew./vol). Die maximale Menge an ANL, die dem Trinkwasser zugesetzt wird, beträgt 1% (Gew./Vol.). Sobald die Mischung fertig ist, sterilisieren Sie sie durch Filtration und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Geben Sie die in Schritt 1.1 vorbereitete Mischung den Mäusen. Wechseln Sie die Flaschen häufig (z. B. alle 3 Tage), um Verunreinigungen zu vermeiden, und überprüfen Sie sie täglich, um nach möglichen Verunreinigungen oder Verstopfungen zu suchen. Überwachen Sie die Menge an getrunkenem Wasser täglich, indem Sie es wiegen, um die ANL-Aufnahme von Mäusen zu kennen.
HINWEIS: Die hier bewertete maximale Kennzeichnungsdauer beträgt 3 Wochen bei einer ANL-Konzentration von 1% im Trinkwasser, was zu einer gut nachweisbaren Kennzeichnung im Gehirn führte. Eine gute Kennzeichnung kann auch in 2 Wochen erreicht werden. Weder kürzere Etikettierzeiten, noch längere Zeitpunkte, noch andere ANL-Mengen wurden von uns mit dieser Verabreichungsmethode untersucht, was nicht bedeutet, dass das Vorstehende nicht funktionieren würde. Die ANL-Inkorporationsraten können je nach untersuchtem Gewebe- oder Zelltyp variieren. Der Zeitpunkt der Kennzeichnung kann je nach wissenschaftlicher Fragestellung variieren; Wenn beispielsweise Proteome markiert werden sollen, sollte die Markierungszeit in Abhängigkeit von den durchschnittlichen Halbwertszeiten der Proteine im untersuchten Gewebe berechnet werden. Wenn das Interesse nur darin besteht, neu synthetisierte Proteine zu identifizieren, können die Zeiten verkürzt werden. Die Markierungszeiträume und ANL-Dosierungen müssen für jeden experimentellen Zustand und Zelltyp empirisch getestet werden.
- Intraperitoneale Verabreichung:
- ANL in physiologischer NaCl-Lösung zu 400 mM, Phosphatsalzlösungspuffer (PBS) oder Wasser auflösen.
- Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität der Lösung im physiologischen Bereich liegt. Hier werden den Mäusen 10 ml/kg Körpergewicht ANL-Lösung verabreicht.
HINWEIS: Eine gute Markierung in den erregenden Neuronen des Gehirns wird erfolgreich durch eine tägliche intraperitoneale Injektion (IP) mit 400 mM ANL für 1 Woche erreicht. Weder niedrigere ANL-Konzentrationen noch andere Markierungszeiträume durch IP-Injektionen wurden in dieser Studie getestet, was nicht bedeutet, dass sie nicht funktionieren würden. ANL wird von einigen Unternehmen als Hydrochlorid geliefert. In diesem Fall muss der pH-Wert der Lösungen auf den adäquaten pH-Wert eingestellt werden (abhängig vom Verabreichungsweg). ANL kann auch nach der von Link et al.11 veröffentlichten Methode mit einigen Modifikationen synthetisiert werden5. Die ANL-Kennzeichnung kann unter Verwendung anderer ANL-Konzentrationen, Zeitspannen und Verabreichungswege durchgeführt werden. Für Gewebe-/Zelltypen mit niedrigen Stoffwechselraten kann eine Methionin-Diät mit niedrigem Gehalt verwendet werden, die immer 1 Woche vor der ANL-Verabreichung beginnt. Wenn 400 mM ANL verwendet wird, kann es bei Lagerung bei 4 °C ausfallen; Eine Erwärmung auf 37 °C bringt ANL wieder in die Lösung. Lassen Sie es vor der Injektion Raumtemperatur erreichen. In den meisten Weltregionen ist die ANL-Verabreichung an Mäusen ein Tierversuch und muss von den zuständigen Behörden genehmigt werden.
2. Gewebegewinnung, Lyse und Proteinextraktion
- Gewebedissektion: Sezieren Sie den Bereich des Gewebes, der den interessierenden Zelltyp enthält, und notieren Sie das Gewicht des gesammelten Gewebestücks.
HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). Im vorliegenden Protokoll wurden der Kortex und der Hippocampus der Mäuse seziert. - Gewebelyse: Homogenisieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur durch Zugabe eines Volumens, das das 12-15-fache des Nassgewichts des Gewebes des Lysepuffers beträgt (PBS pH 7,4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), ein Proteaseinhibitor (PI) (EDTA-frei 1:4000)). Zum Beispiel fügen Sie für ein 20 mg Gewebestück 240-300 μL Lysepuffer hinzu. Trituieren Sie das Gewebe, bis es homogenisiert ist.
HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). Für die direkte Homogenisierung in 1,5-ml-Röhrchen empfiehlt sich die Verwendung eines tragbaren, batteriebetriebenen Homogenisators, insbesondere wenn kleine Gewebestücke verarbeitet werden. Für größere Stücke kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden. Zu jedem Puffer, in dem Proteaseinhibitoren (PI) enthalten sind, sollten sie unmittelbar vor der Verwendung und nicht früher hinzugefügt werden. - Proteindenaturierung: Das Homogenat 15 min auf 75 °C erhitzen und bei 17.000 x g 15 min bei 10 °C zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre.
- Messung des Proteingehalts: Messen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe und passen Sie alle Proben an, um sie mit derselben Proteinkonzentration zu vergleichen. Passen Sie die Konzentration durch Hinzufügen von Lysepuffer an. Ein optimaler Konzentrationsbereich liegt zwischen 2-4 μg/μL.
HINWEIS: Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). - Alkylierung
- Die homogenisierten Proben werden um das 2-3-fache in PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-frei 1:4000) verdünnt.
- Iodoacetamid (IAA) zu einer Endkonzentration von 20 mM (Stammlösung 500 mM) zugeben.
- Die Proben 1-2 h bei 20 °C im Dunkeln stehen lassen. Führen Sie die Schritte 2.5.2-2.5.3 zweimal aus.
HINWEIS: Wenn bei einigen Geweben der unspezifische Klick in der Negativkontrolle hoch bleibt, kann es notwendig sein, vor der Alkylierung einen Reduktionsschritt durchzuführen12. Bereiten Sie den IAA-Bestand frisch vor, bevor Sie ihn den Mustern hinzufügen. Die Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt).
- Pufferaustausch: Gleichgewichtspufferaustauschsäulen unter Verwendung des Klickchemie-Austauschpuffers (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:4000)). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Austauschen Sie alle alkylierten Proben.
HINWEIS: Eluierte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). In diesem Schritt wird die IAA eliminiert und der Puffer durch den Klickchemiepuffer ausgetauscht. Das Protein kann nach dem Pufferaustauschschritt erneut gemessen werden, um sicherzustellen, dass die Proteine während des Pufferaustauschprozesses nicht verloren gegangen sind. Abhängig von der Art der Säulen, die für den Pufferaustausch verwendet werden, kann Protein massiv verloren gehen. Verwenden Sie die empfohlenen Säulen, um Proteinverlust zu vermeiden. Für die Probenlagerung wird die Herstellung von Aliquoten empfohlen. - Klicken Sie auf die Reaktion, um die ANL-Einbeziehung in das Experiment zu bewerten
- Nehmen Sie 40 μL der eluierten Proben in Schritt 2.6 und geben Sie PBS (pH 7,8) zu einem Endvolumen von 120 μL.
- Um die Klickchemiereaktion einzurichten, fügen Sie die folgenden Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge und im Wirbel für 20 s nach jeder Zugabe hinzu: 1,5 μL Triazolligand (Stamm 40 mM), 1,5 μL Biotinalkinkinen (Stamm 5 mM) und 1 μL Cu(I)-bromid (Brühe 10 mg/ml, gelöst in DMSO durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab, nicht wirbeln). Fügen Sie die Reagenzien so schnell wie möglich hinzu.
- Die Proben über Nacht im Dunkeln bei 4 °C in kontinuierlicher Rotation inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C für 5 min bei 17.000 x g. Ein leicht türkisfarbenes Pellet wird sichtbar sein. Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre.
HINWEIS: Bereiten Sie Cu (I) -bromidbrühe unmittelbar vor Gebrauch vor, um Kupferoxidation zu vermeiden. Das Verhältnis der Volumina zwischen der lysierten Probe und PBS zwischen den Proben konstant zu halten, ist wichtig, um die gleiche Endreinigungsmittelkonzentration in jedem Röhrchen zu gewährleisten. Um den Aufbau der Klickchemiereaktion zu beschleunigen, wird ein Tischwirbel mit Racks für Rohre empfohlen. Lagern Sie die angeklickten Proben mehrere Monate bei -80 °C oder einige Wochen bei -20 °C bis zur Weiterverarbeitung (Stopppunkt).
- Western-Blot-Analyse zur Bewertung der ANL-Einbeziehung in das Experiment
- Führen Sie eine SDS-PAGE mit 20-40 μL des Überstands aus der Klickchemiereaktion durch (Schritt 2.7). Verwenden Sie 12% Acrylamidgele, laufen Sie in 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM Glycin. Laufen lassen, bis die Vorderseite aus dem Gel heraus ist.
- Übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran13.
- Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit einem GFP-Antikörper (1:500, GFP-Protein wird mit MetRS*5 co-translatiert) und einem Biotin-Antikörper (1:1000) zum Nachweis von angeklicktem Alkin, das mit Biotin konjugiert ist.
- Waschen Sie den primären Antikörper 2 mal für 10 min und fügen Sie den sekundären Antikörper für 1,5 h hinzu.
- Waschen Sie den sekundären Antikörper 2-mal für 10 Minuten und scannen Sie (bei Verwendung von fluorophorkonjugierten Antikörpern) oder besetzen Sie ihn Filmen (bei Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpern).
- Quantifizieren Sie das Biotinsignal mit ImageJ oder einer ähnlichen Software, bewerten Sie die allgemeine Markierung jeder Probe des Experiments und erkennen Sie mögliche Ausreißer. Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (ANL-Probenmarkierung zum Hintergrund der Negativkontrollen) des Experiments und erkennen Sie mögliche Tiere, die ANL nicht aufgenommen / aufgenommen haben.
HINWEIS: Für Proben mit hohem ANL-Einbau ist eine Proteinreinigung theoretisch mit nicht spaltbaren Alkinen möglich, wie sie in diesem Abschnitt zur Bewertung der ANL-Inkorporation verwendet werden. Unter Verwendung von Gehirnproben ist der Hintergrund, der in den Negativkontrollen von MS nach Proteinreinigung mit nicht spaltbaren Alkinen erhalten wird, zu hoch14. Daher wurden für eine erste allgemeine Proben- und Versuchsauswertung nur die leichter zu handhabenden, nicht spaltbaren Alkine verwendet. Unabhängig von der Art des Alkins, das für die Proteinreinigung bestimmt ist, ist es ratsam, die im folgenden Abschnitt beschriebenen Schritte zur Optimierung der Alkindosierung durchzuführen (Schritt 2.9).
- Klickreaktion zur Optimierung der spaltbaren Alkindosierung
- Vier Röhrchen mit 40 μL einer repräsentativen Probe (in Schritt 2.6 erhalten und in Schritt 2.8 bewertet) vorbereiten und PBS (pH 7,8) zu einem Endvolumen von 120 μL hinzufügen.
- Richten Sie die Klickchemiereaktion wie in Schritt 2.7 beschrieben ein, aber fügen Sie diesmal vier verschiedene Mengen des DST-Alkins hinzu. Für besagtes Alkin wird empfohlen, 5 μM, 15 μM, 30 μM und 60 μM zu testen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.8, um zu entscheiden, welche Alkindosierung für die spezifische experimentelle Fragestellung am besten geeignet ist, basierend auf der höchsten Markierungseffizienz mit dem niedrigsten Hintergrundsignal.
HINWEIS: Bevor die restlichen Proben einer Klickreaktion unterzogen werden, muss die optimale Menge eines Alkins bestimmt werden. Es gibt mehrere Optionen von kommerziell erhältlichen Alkinen, die verwendet werden können. Sie unterscheiden sich in der Art der Spaltung (z.B. Licht oder Reduktionsmittel). Eine kupferfreie Klickchemie mit stammgeförderten Reagenzien (z.B. DBCO-Reagenzien) ist ebenfalls möglich. Winzige Änderungen in der Menge an Alkinen oder DBCO-Reagenzien erhöhen oft das Signal in der Negativkontrolle (Hintergrund) signifikant. Hierbei wird die Proteinreinigung unter Verwendung eines Alkins mit einer durch Reduktionsmittel spaltbaren Disulfidbrücke (Disulfidbiotinalkin oder DST-Alkin15) beschrieben. Wenn Sie das DST-Alkin verwenden, vermeiden Sie zum Ausführen der SDS-PAGE (Schritt 8.1) das Laden von Puffern mit starken Reduktionsmitteln wie DTT oder β-Mercaptoethanol, um eine Alkinspaltung zu verhindern. In dieser Studie hat das 5-minütige Erhitzen bei 72 °C unter Verwendung von 5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) im Ladepuffer keinen Einfluss auf die Stabilität der DST-Alkin. Schritt 2.9.2 kann wiederholt werden, wobei feinkörnigere Dosierungen im Bereich der besten beobachteten getestet werden.
- Präparative Klickreaktion zur Proteinreinigung
- Klicken Sie auf alle in Schritt 2.6 erhaltenen Proben mit der in Schritt 2.9 ermittelten optimalen Alkindosis und analysieren Sie eine Fraktion mittels SDS-PAGE und Western Blot (Schritt 2.8).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pipetten ordnungsgemäß kalibriert sind, um die Genauigkeit der Probenhochskalierung zu gewährleisten. Geklickte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt).
- Klicken Sie auf alle in Schritt 2.6 erhaltenen Proben mit der in Schritt 2.9 ermittelten optimalen Alkindosis und analysieren Sie eine Fraktion mittels SDS-PAGE und Western Blot (Schritt 2.8).
3. Proteinreinigung
- Pufferaustausch
- Alle angeklickten Proben einem Pufferaustauschverfahren wie in Schritt 2.6 beschrieben unterziehen, aber Neutravidin-Bindungspuffer als Gleichgewichtspuffer verwenden (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:2000)).
HINWEIS: Eluierte Proben können mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden (Stopppunkt). In diesem Schritt wird das nicht angeklickte freie Alkin eliminiert und der Puffer durch den Neutravidin-Bindungspuffer ausgetauscht.
- Alle angeklickten Proben einem Pufferaustauschverfahren wie in Schritt 2.6 beschrieben unterziehen, aber Neutravidin-Bindungspuffer als Gleichgewichtspuffer verwenden (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:2000)).
- Bindung an Neutravidin-Perlen
- Die Neutravidin-Hochleistungskügelchen werden mit dem Neutravidin-Bindungspuffer gewaschen (siehe Schritt 3.1); Mischen Sie die Perlen mit dem Puffer und zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 3000 x g und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Bereiten Sie eine 1:1-Aufschlämmung aus Neutravidin-Perlen vor, indem Sie das gleiche Volumen an Trockenkügelchen und Neutravidin-Bindungspuffer hinzufügen.
- Von jeder Probe werden 20-40 μL als vorgereinigtes Lysat beiseite gelegt und bei -20 °C gelagert.
- Die Proteinkonzentration wird gemessen (siehe Schritt 2.4) und 100 μg Protein mit 4 μl der in Schritt 3.2.2 erhaltenen Aufschlämmung gemischt.
- Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 4 °C in kontinuierlicher Rotation, damit markierte Proteine an die Beads binden können.
HINWEIS: Wie bei der Klickchemiereaktion kann die in Schritt 3.2.4 beschriebene grundlegende Affinitätsreinigungsreaktion hochskaliert werden. Zum Beispiel wird zur Reinigung von Proteinen aus den exzitatorischen Neuronen des Hippocampus 1 mg Proteinlysat mit 40 μL Neutravidin-Perlen (1:1-Aufschlämmung) gemischt. Die Menge an Neutravidin-Perlen kann entsprechend der Menge der markierten Proteine pro mg Gesamtprotein nach oben oder unten skaliert werden, was vom gewählten Zelltyp und der Markierungsperiode abhängt und empirisch bestimmt werden muss.
- Neutravidin-Perlen waschen und Proteinelution
- Sammeln Sie die Überstände durch Zentrifugation (siehe Schritt 3.2.1). 20-40 μl Aliquot jedes Überstands für eine spätere Analyse beiseite legen und den Rest bei -80 °C einfrieren.
- Waschen Sie die Perlen mit gekühltem Neutravidin-Waschpuffer 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 und PI (1:2000)), indem Sie den Puffer hinzufügen, die Perlen sedimentieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Dann fügen Sie den gleichen Puffer hinzu und inkubieren Sie die Perlen für 10 Minuten unter kontinuierlicher Rotation bei 4 °C, bevor Sie den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Waschen Sie die Perlen wie in den Schritten 3.3.2-3.3.3 beschrieben, jedoch mit Neutravidin Waschpuffer 2 (1x PBS, pH 7,4 und PI 1:2000).
- Die Perlen werden wie im Schritt 3.3.2-3.3.3 erläutert, jedoch mit Neutravidin-Waschpuffer 3 (50 mM Ammoniumbicarbonat und PI 1:2000) gewaschen.
- Eluieren Sie die geklickten Proteine, indem Sie die Beads für 30 min bei 20 °C mit einem Volumen Neutravidin-Elutionspuffer (5% (vol/vol) β-Mercaptoethanol und 0,03% (wt/vol) SDS) entsprechend einem Volumen der verwendeten Trockenkügelchen inkubieren.
- Halten Sie die Perlen während der Elution durch kontinuierliches Rühren (1000 U/min) in einem Thermoblock-Shaker in Schwebe. Eluieren Sie zweimal und kombinieren Sie beide Eluate.
ANMERKUNG: Die Zentrifugation zur Trennung des festen Anteils der Aufschlämmung (Perlen) und der wässrigen Phase (Überstand), wie in Schritt 3.2.1 erläutert, gilt für die Schritte 3.3.1-3.3.7. Die SDS-Menge kann erhöht werden, wenn die Proteinelution nicht vollständig ist. Bei Mengen über 0,08%-0,1% SDS beginnen jedoch Proteine, die unspezifisch an die Perlen gebunden sind, eluiert zu werden. β-Mercaptoethanol ist flüchtig und giftig; Die Verwendung einer Haube für die Schritte 3.3.6-3.3.7 ist ratsam. Die in den Schritten 3.2.3 und 3.3.1 gesammelten Proben sollten von SDS-PAGE durchgeführt und von Western Blot ausgewertet werden (siehe Schritt 2.8), um die Effizienz der Affinitätsreinigung zu bewerten (Schritt 3.3).
- Bewertung von eluierten Proteinen
- Laden Sie 1/3 der eluierten Samples auf eine SDS-PAGE (siehe Schritt 2.8.1).
- Färben Sie das Gel, um Proteine mit einer hochempfindlichen Methode wie Silberfärbung oder einer fluoreszierenden Methode sichtbar zu machen.
- Wenn die Proben die erwartete Qualität aufweisen, was bedeutet, dass in den ANL-markierten Proben im Vergleich zur Negativkontrolle 3-4-fach mehr Protein enthalten ist, können die eluierten Proteine durch routinemäßige massenspektrometrische Methoden wie die in Referenz5 erläuterte identifiziert werden.
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Representative Results
Gemäß dem beschriebenen Protokoll (zusammengefasst in Abbildung 1) wurde ANL Mäusen entweder durch tägliche intraperitoneale Injektionen (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) für 7 Tage oder über Trinkwasser (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) für 21 Tage verabreicht. Nach der Markierung wurden die entsprechenden Hirnareale seziert, lysiert, alkyliert und angeklickt. Klickreaktionen wurden von SDS-PAGE und Western Immunoblot analysiert. Repräsentative Bilder der Experimente sind in Abbildung 2 für die ANL-Verabreichung durch IP-Injektion und in Abbildung 3 für die ANL-Verabreichung über Trinkwasser dargestellt. Beachten Sie, dass das Ziel der Abbildungen darin besteht, zu zeigen, dass beide Kennzeichnungsprotokolle funktionieren, und nicht, sie zu vergleichen. Ein Vergleich ist nicht möglich, da in den beiden gezeigten Experimenten unterschiedliche neuronale Populationen markiert sind (exzitatorische Neuronen des Hippocampus und Kortex sowie die Purkinje-Neuronen des Kleinhirns).
Ein weiteres Experiment liefert ein Beispiel für die Bestimmung der optimalen DST-spaltbaren Alkinkonzentration (Abbildung 4). In diesem Beispiel ist die Faltenänderung zwischen markierter Probe und Kontrolle bei einer Alkinkonzentration von 14 μM am höchsten. Diese Alkinkonzentration wird dann auf alle Proben angewendet. Nach Überprüfung der Markierung jeder Probe im Experiment mit der gewählten Alkinmenge wurden alle Proben der Reinigung von ANL-markierten/biotingeklickten Proteinen durch Affinitätsbindung unter Verwendung von Neutravidinperlen unterzogen (Abbildung 5). In diesem Schritt werden Proteine an die Perlen gebunden, gewaschen und anschließend eluiert, indem die im DST-Alkin vorhandene Disulfidbrücke reduziert wird. Nach diesem letzten Schritt bleiben das Biotin und ein Teil des Alkins an die Perlen gebunden. Die ANL-haltigen Proteine (gebunden an den Rest des Alkins) werden im Elutionspuffer zurückgewonnen. Um die Effizienz des Elutionsschritts zu bewerten, wird ein Drittel des Eluatvolumens auf ein SDS-PAGE-Gel geladen und mit einer sensitiven Gesamtproteinfärbemethode visualisiert. Es muss ein mindestens 3-facher Intensitätsunterschied der Gesamtproteinfärbung zwischen Negativkontrollen und ANL-markierten Proben beobachtet werden, um interpretierbare Ergebnisse mit Massenspektrometrie zu erzielen. Nach Abschluss aller in diesem Protokoll beschriebenen Schritte folgt die Vorbereitung, Entnahme und Analyse der MS-Probe5. Obwohl es keine besonderen Anforderungen für MS gibt (jedes Labor kann sein routinemäßiges MS-Protokoll 5,10 verwenden), sollte beachtet werden, dass die Menge an gereinigten Proteinen im Allgemeinen gering ist (in der Größenordnung von Nanogramm). Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für MS-Ergebnisse mit einer deutlichen Anreicherung in der ANL-markierten Probe im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 6A). Dieser Unterschied war bereits in der in Abbildung 5 gezeigten Gesamtproteinfärbung sichtbar. Neben Änderungen der Peptidintensität finden sich in beiden Proben auch einzigartige Proteine (Abbildung 6B).
Abbildung 1: Arbeitspipeline für die zelltypspezifische Proteinreinigung durch BONCAT. Nach der Proteinmarkierung mit ANL wird das interessierende Gewebe seziert und lysiert, mit Biotin durch Klickchemie markiert und die Menge der Markierung für jede Probe wird von BONCAT bewertet. Ausreißer (die keine ANL enthalten) und repräsentative Stichproben können in diesem Schritt unterschieden werden. Eine der repräsentativen Proben wird erneut angeklickt, um die optimierte spaltbare Alkindosierung für die anschließende Proteinreinigung zu finden. Die Alkindosierung, die das beste Signal-Rausch-Verhältnis erreicht, wird auf jede biologische Replikation angewendet. Zelltypspezifische Proteine werden durch Affinitätsreinigung gewonnen. Gereinigte Proben werden mittels Massenspektrometrie untersucht und Proteine identifiziert. Diese Abbildung wurde von Alvarez-Castelao et al. (2017)6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: ANL-Verabreichung durch intraperitoneale Injektionen (IP). BONCAT wurde durchgeführt, um die Proteinmarkierung im Hippocampus (HP) und Kortex (CX) nach metabolischer Markierung von Proteinen mit ANL durch tägliche IP-Injektionen für 7 Tage zu bewerten. Wildtyp-Mäuseproben als Negativkontrolle (wt) wurden parallel zu den markierten Proben (MetRS*) angeklickt. Die markierten Proteine stammen von den exzitatorischen Neuronen unter Verwendung einer Nex-Cre::MetRS*-Linie16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: ANL-Verabreichung durch Trinkwasser. BONCAT wurde durchgeführt, um die Proteinmarkierung in den Purkinje-Neuronen des Kleinhirns nach Verabreichung von ANL an GAD-Cre::MetRS *-Mäuse über Trinkwasser für 21 Tage zu bewerten. Die Abbildung zeigt eine Negativkontrolle (wt) und eine markierte Probe (MetRS*), die parallel lysiert und angeklickt wurden. Diese Abbildung wurde von Alvarez-Castelao et al. (2017)6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: DST-Alkin-Distitration. Ein biologischer Replikat pro Experiment wird als repräsentative Probe ausgewählt, um die optimale Alkinkonzentration zu titrieren. Drei Konzentrationen (14, 28 und 56 μM) des Alkins wurden hier in der Klickreaktion für BONSAT getestet. Das Markierungsverhältnis zwischen der ANL-markierten Probe (MetRS*) und der Negativkontrolle (wt) bestimmt das Signal-Rausch-Verhältnis (in der Grafik dargestellt). 14 μM ist die beste Alkinkonzentration, die in diesem Experiment erhalten wurde. Für dieses Experiment wurde Kortexgewebe aus der ANL-markierten Mauslinie Nex::MetRS* verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Gereinigte Proteine. Markierte Proteine aus Purkinje-Neuronen wurden mit SYPRO Ruby gereinigt und gefärbt. Diese Abbildung wurde von Alvarez-Castelao et al. (2017)6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Proteinidentifizierung und -quantifizierung. Das Purkinje-Zellproteom wurde mittels Massenspektrometrie unter Verwendung des Kleinhirns aus einer GAD-Cre::MetRS*-Mauslinie als Ausgangsmaterial gewonnen. (A) zeigt erhöhte Häufigkeiten (Peptidintensität) der identifizierten Proteine in ANL-markierten Proben im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (wt). (B) Das Purkinje-Proteom wurde durch Pooling von Proteinen erhalten, die in den ANL-markierten Proben in A angereichert sind (definiert durch >3-fache Intensitäten in MetRS*-Mäusen im Vergleich zu wt) und einzigartigen Proteinen, die in den MetRS*-exprimierenden Mäusen gefunden wurden. Diese Abbildung wurde von Alvarez-Castelao et al. (2017)6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die kritischen Aspekte des Protokolls sind: die Einbeziehung von Negativkontrollen, genügend biologische Replikate, ANL-Verabreichungsweg, Menge und Dauer, Alkylierung der Proben, Alkinkonzentration und β-Mercaptoethanol-Eliminierung bei Verwendung von DST-Alkin.
Es ist wichtig, Negativkontrollproben von ANL-markierten Tieren ohne Cre-Treiber und daher ohne MetRS*-Expression einzubeziehen. Diese Proben müssen jedem im Protokoll beschriebenen Schritt parallel zu den Proben von ANL-markierten Cre-induzierten MetRS*-Mäusen unterzogen werden. Nicht angeklickte Beispiele sind keine gültigen Steuerelemente, da alle Ergebnisse, die nur mit diesem Steuerelement erzielt werden, auf unspezifische Klicks zurückzuführen sein können. Wir haben weder den Einbau von ANL in Zellen beobachtet, die das MetRS*-Gen exprimieren, noch die MetRS*-Expression in Zellen ohne Cre; Daher können mit ANL markierte Masttiere als Negativkontrolle verwendet werden.
Da das hier beschriebene Protokoll aus vielen Schritten besteht, bei denen Proben verloren gehen können, wird empfohlen, biologische Replikate unter Berücksichtigung des technischen Versagens zu berechnen. Bei Gehirnproben gibt es einen Replikationsverlust von etwa 30%.
Wir beschreiben hier zwei ANL-Verabreichungswege und -dauern. Dies schließt nicht aus, dass andere Verabreichungswege (z. B. Zugabe von ANL zum Lebensmittel) ebenso gut funktionieren. In Bezug auf die verabreichte ANL-Menge wurden die hier gezeigten Experimente mit relativ hohen Mengen an ANL durchgeführt. Je nach Versuchsaufbau ist auch eine Kennzeichnung mit geringeren Mengen möglich. Die kürzeste Zeitspanne der ANL-Kennzeichnung, die in diesem Protokoll angegeben wird, beträgt 1 Woche und die längste 21 Tage. Kürzere oder längere Kennzeichnungszeiträume könnten angewendet werden, aber wir haben es nicht festgelegt. Die Forscher sollten den ANL-Verabreichungsweg, die ANL-Dosierung und den ANL-Markierungszeitraum bestimmen, die für die spezifische experimentelle Fragestellung angemessen sind, indem sie die metabolischen Eigenschaften des Gewebes, den interessierenden Zelltyp und die untersuchte experimentelle Frage berücksichtigen.
Die Probenalkylierung, auch bekannt als Capping, ist ein wichtiger Schritt, um Hintergrundklick17 zu vermeiden. Wenn die Alkylierung ordnungsgemäß durchgeführt wird, wird das unspezifische Klicken reduziert, das von den Kontrollproben überwacht wird, und der Unterschied zwischen den negativen Kontrollproben und den ANL-markierten Proben ist größer. Die Eliminierung der freien IAA nach der Alkylierung ist ebenfalls ein wichtiger Schritt. Das Vorhandensein kleiner Mengen von IAA während der Klickreaktion schränkt seine Effizienz ein. Gelegentlich muss der Entsalzungsschritt, der auch IAA eliminiert (Schritt 2.6), wiederholt werden, um eine ordnungsgemäße Entfernung von IAA zu gewährleisten.
Es gibt mehrere Biotin-Alkine und -DBCO-Reagenzien, die von einer Vielzahl von Unternehmen kommerziell erhältlich sind. Die Hauptunterschiede zwischen ihnen betreffen die Polyethylenglykol (PEG) -Linkerkettenlänge und das Fehlen, Vorhandensein und die Art der spaltbaren Gruppen. Unabhängig vom verwendeten Typ führen überschüssige Mengen an Alkinen zu unspezifischen Klicks auf Proteine, die nur natürliche Aminosäuren enthalten. Dies kann durch präzise und sorgfältige Titration der Alkinmenge leicht verhindert werden. Wie beschrieben, ist der beste Weg, dies zu erreichen, die Verwendung der tatsächlich lysierten und alkylierten Proben, die in den nachfolgenden Proteinreinigungsschritten (Schritt 2.6) und der massenspektrometrischen Analyse verwendet werden.
Wenn DST-Alkine in der Klickreaktion verwendet werden, reduziert β-Mercaptoethanol die Disulfidbrücke und dissoziiert die markierten Proteine von den Beads im Elutionsschritt (Schritt 3.3). β-Mercaptoethanol muss aus den Proben entfernt werden, um den für MS erforderlichen enzymatischen Aufschluss zu ermöglichen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu tun (z. B. Lyophilisation18, Exzision aus einem Gel19 oder Reinigung mit S-Trap-Säulen20), und die Wahl sollte vom MS-Labor getroffen werden, das die Proben verarbeitet.
Änderungen und Fehlerbehebung der Methode sollten gerichtet werden, um die im Protokoll genannten kritischen Schritte zu optimieren. Zum Beispiel, wenn es zu viel Variabilität gibt, fügen Sie mehr biologische Replikate hinzu; Wenn die Markierung zu niedrig ist, erhöhen Sie die ANL-Konzentration, verwenden Sie längere Markierungszeiten oder testen Sie andere ANL-Verabreichungswege, die für das untersuchte Gewebe effizienter sein könnten. Für die Proteinalkylierung konnte ein vorheriger Reduktionsschritt zur Zugabe von IAA implementiert werden.
Die Haupteinschränkung der Methode ist die Reinigung von Proteomen, die aus kleinen Zellpopulationen entstehen, auch wenn ein kleiner Gewebebereich seziert wird. Schwer zugänglich sind jedoch auch Proteome zahlreicherer Zellpopulationen, die über größere Gewebebereiche verteilt sind. Dennoch kann die hier beschriebene in vivo Markierungstechnik weiterhin angewendet werden, um die genannten Zelltypen bildgebend zu beurteilen (z.B. mit FUNCAT oder FUNCAT-PLA21).
Diese Methode ist derzeit die einzige verfügbare Methode für die in vivo Untersuchung von zelltypspezifischen Proteomen auf Basis von Proteinen in voller Länge und für die in situ Visualisierung von zelltypspezifischen vollständigen Proteinen. Andere nicht-kanonische Aminosäuren wie Azidohomoalanin (AHA) können auch für die In-vivo-Proteinmarkierung und Reinigung von Proteomen verwendet werden, haben jedoch keine Zelltyp-Spezifität22,23. Andere Ansätze wie Puromycin eignen sich, um ein festes Bild der Proteinsynthesezu liefern 24,25. Dennoch ist die Verwendung nicht-kanonischer Aminosäuren für längere Markierungszeiträume möglich, was auch den Proteinabbau widerspiegelt und ein genaueres zelluläres Proteom zeigt. BioID-basierte Methoden werden verwendet, um Proteine in bestimmten subzellulären Regionen zu identifizieren, unabhängig von ihrem Zeitpunkt / Ort der Synthese26.
In der von uns etablierten Mauslinie (erhältlich bei Jackson Lab, Lagernummer 028071) wird die mutierte Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die den Einbau von ANL in die Zellen ermöglicht, Cre-abhängig exprimiert. Mit dieser Mauslinie als Werkzeug ist es möglich, die MetRS* ausschließlich in Zelltypen auszudrücken, für die Cre-Treiberlinien verfügbar sind. Diese Anordnung verleiht der Methode eine beträchtliche Vielseitigkeit und macht sie in fast jedem Bereich der biomedizinischen Forschung nützlich.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
B.A-C wird vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) und MICINN (PID2020-113270RA-I00) finanziert. R. A-P wird von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) finanziert. E.M.S. wird gefördert durch die Max-Planck-Gesellschaft, einen Advanced Investigator Award des Europäischen Forschungsrats (grant 743216), den DFG-SFB 1080: Molekulare und zelluläre Mechanismen der neuronalen Homöostase und den DFG-SFB 902: Molekulare Prinzipien der RNA-basierten Regulation. Wir danken D.C. Dieterich und P. Landgraf für ihre technische Beratung und die Synthese des DST-Alkin. Wir danken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast und der Tiereinrichtung des MPI für Hirnforschung für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Sandra Goebbels für das Teilen der Nex-Cre Mauslinie. Wir danken Antonio G. Carroggio für seine Hilfe bei der englischen Redaktion. B.A-C. entwarf, führte und analysierte Experimente. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. und S. t. D. führte Experimente durch und analysierte sie. B.A-C und E.M.S. entwarfen Experimente und überwachten das Projekt, B.A-C schrieb das Papier. Alle Autoren haben das Papier bearbeitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
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