JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/63729
,
1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, 2Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

Summary

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + ‘nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

Abstract

İç mitokondriyal membrandaki (IMM) ubikinon (CoQ) havuzları kısmen kompleks I veya FAD’ye bağımlı enzimlere bölünmüştür. Bu tür bir alt bölüm, sitokrom c (cyt c) indirgemesinin ölçüldüğü dondurulmuş çözülmüş mitokondride elektron donörü olarak NADH veya süksinat kullanılarak karşılaştırmalı bir tahlil ile kolayca değerlendirilebilir. Tahlil, Na+‘nın İBB üzerindeki etkisine dayanıyor ve akışkanlığını azaltıyor. Burada, NaCl veya KCl varlığında NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesini ve süksinat-cyt c oksidoredüktaz aktivitelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bir küvetteki reaktiflerin karışımına kademeli olarak dayanan reaksiyonlar, Na + veya K + varlığında 4 dakika boyunca spektrofotometrik olarak ölçülür. Aynı karışım, absorbanstaki spesifik olmayan değişikliği çıkarmak için spesifik enzim inhibitörlerinin varlığında paralel olarak gerçekleştirilir. NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesi bu katyonların hiçbirinin varlığında azalmaz. Bununla birlikte, süksinat-sit-c oksidoredüktaz aktivitesi NaCl varlığında azalır. Bu basit deney şunları vurgulamaktadır: 1) Na+‘nın İBB akışkanlığını ve CoQ transferini azaltmadaki etkisi; 2) süperkompleks I+III2’nin ubikinon (CoQ) transferini İBB akışkanlığını düşürerek etkilenmekten koruduğunu; 3) CI ve CIII arasındaki CoQ transferinin işlevsel olarak CII ve CIII arasındaki CoQ transferinden farklı olması. Bu gerçekler, İBB’de işlevsel olarak farklılaşmış CoQ havuzlarının varlığını desteklemekte ve mitokondrinin değişen Na + ortamı tarafından düzenlenebileceğini göstermektedir.

Introduction

Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sistemi (OXPHOS), adenozin trifosfat (ATP) sentezini, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini ve nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) veya süksinat gibi indirgeyici eşdeğerlerin mitokondri ile tüketimini yönlendiren ana yoldur. OXPHOS sistemi beş protein kompleksinden oluşur: Kompleks I (CI) NADH’yi oksitler ve CoQ’yu ubikinol (CoQH2) içine indirir. Kompleks II (CII), süksinatı fumarata oksitler ve CoQ’yu CoQH2’ye düşürür. Kompleks III (CIII), CoQH 2’yi tekrar CoQ’ya oksitleyerek sitokromc’yi (cyt c) azaltır. Son olarak, kompleks IV (CIV) cyt c’yi oksitler ve suya giden oksijeni azaltır. Elektron taşıma zinciri (mETC) olarak adlandırılan bu oksidoredüksiyon zinciri, adenozin difosfatı (ADP) ATP’ye fosforile etmek için kompleks V (CV) tarafından kullanılan bir elektrokimyasal gradyan oluşturan İBB boyunca H + ‘nın pompalanmasıyla birleştirilir.

mETC kompleksleri İBB’de tek başına olabilir veya süperkompleksler adı verilen kuaterner yapılara toplanabilir. CIV CIV ile birleşerek III2+IV veya Q-solunum solunumu oluşturabilir (CoQH 2 varlığında yeniden canlanabildiği için)1,2,3 veya homodimerler veya homooligomerleroluşturabilir 4. CIII CI ile etkileşime girerek süperkompleks I+III2 5’i oluşturabilir. Son olarak, CI ayrıca Q-solunum ile etkileşime girebilir, I + III2 + IV veya N-solunum solunumu (NADH’yi tüketerek nefes alabildiği için) 1,6,7,8,9,10’u inşa edebilir.

CoQ ve cyt c, sırasıyla CI / CII’den CIII’ye ve CIII’den CIV’ye elektron aktarmaktan sorumlu mobil elektron taşıyıcılarıdır. Süper komplekslerin bu taşıyıcılar için işlevsel bir yerel kısıtlama getirip getirmediği, son yirmi yılda 2,7,11,12,13,14,15,16,17 tarihinde yoğun bir tartışma konusu olmuştur. Bununla birlikte, birkaç bağımsız grup, CoQ ve cyt c’nin İBB’deki havuzlara işlevsel olarak bölünebileceğini göstermiştir. CoQ ile ilgili olarak, işlevsel olarak CI için belirli bir CoQ havuzuna (CoQNAD) ve FAD’ye bağımlı enzimlere (CoQFAD) adanmış başka bir havuza ayrılabilir 1,7,12,18,19. Bununla birlikte, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını ayırt etmek için, alternatif oksidazın (AOX) aşırı ekspresyonu ve CIII’nin yokluğunda CI’yi bir araya getirebilen spesifik mtDNA mutantlarının üretilmesi gerekiyordu 1,19,20.

Hipoksi sırasında reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretim mekanizması yakın zamana kadar bilinmiyordu. Akut hipoksi üzerine, CI, H + pompalama NADH-CoQ oksidoredüktaz aktivitesindeki azalmayı içeren aktif / deaktif (A / D) geçişine uğrar. H + pompalamadaki böyle bir azalma, mitokondriyal matrisi asitleştirir ve mitokondriyal matristeki kalsiyum-fosfat çökeltilerini kısmen çözer ve çözünür Ca2 + ‘yı serbest bırakır. Çözünür Ca 2+’daki bu artış, Na+ karşılığında Ca 2+’yı ekstrüzyon yapan Na+/Ca 2+ eşanjörünü (NCLX) aktive eder. Mitokondriyal Na + artışı, İBB’nin iç tarafındaki fosfolipitlerle etkileşime girerek akışkanlığını ve CII ile CIII arasındaki CoQ transferini azaltır ve sonunda bir redoks sinyali21 olan süperoksit anyonu üretir. İlginç bir şekilde, CoQ transferi sadece CII ve CIII arasında azaldı, ancak CI ve CIII arasında değil, 1) Na + ‘nın mitokondrideki mevcut CoQ havuzlarından sadece birini modüle edebildiğini; 2) İBB’de işlevsel olarak farklılaştırılmış CoQ havuzları var. Bu nedenle, mitokondriyal enzim aktivitelerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir protokol, söz konusu CoQ havuzlarının varlığını değerlendirmek için kullanılabilir.

Mevcut protokol, CIII’in substratı olan oksitlenmiş cyt c’nin, süksinat (yani CII substratı) veya NADH (yani CI substratı) varlığında absorbans yoluyla indirgenmesinin ölçülmesine dayanmaktadır. Aynı numune, biri KCl ile, diğeri aynı NaCl konsantrasyonuna sahip olacak şekilde ikiye ayrılır. Bu şekilde, Na+’nın İBB akışkanlığını azalttığı göz önüne alındığında, CoQ İBB’de benzersiz bir havuzda var olsaydı, hem CI+CIII hem de CII+CIII Na+‘nın varlığında azalırdı. Bununla birlikte, CoQ kısmen segmentlere ayrılmış fonksiyonel CoQ havuzlarında mevcut olsaydı, Na + ‘nın etkisi çoğunlukla (veya sadece) CII + CIII aktivitesi üzerinde belirgin olurdu, ancak CI + CIII üzerinde belirgin olmazdı. Yakın zamanda yayınlanan21 gibi, Na+ sadece CII ve CIII arasındaki CoQ transferini etkiler (Şekil 1C,D), ancak CI ve CIII arasında etkilemez (Şekil 1A,B).

Bu protokol, bir dizi teknikle birlikte, İBB’de kısmen parçalanmış fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını doğrulamak için kullanılmıştır, biri CI’ye (yani, CoQNAD) ve diğeri FAD’ye bağlı enzimlere (yani, CoQFAD) adanmıştır 1,3,7; 22 tartışılmaya devam etmesine rağmen, birkaç grup tarafından bağımsız olarak doğrulanan bir gözlem 7,19. Bu nedenle, CI’nin süperkomplekslere üst montajı, CoQ’nun yerel hareketliliğini etkiler ve CIII tarafından 1,7,13,14,23,24,25 süperkompleksi içinde kullanımını kolaylaştırır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Direktifi (2010/63/UE) ve 1 Şubat 2013 tarihli İspanya Kraliyet Kararnamesi (53/2013) uyarınca İspanya’nın Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi. NOT…

Representative Results

Bu protokolden elde edilen tipik sonuçlar aşağıda gösterilmiştir (Şekil 3). Azalmış cyt c absorbansı 550 nm’de bulunduğundan, tüm inhibe edilmemiş alt numuneler 550 nm’de absorbansta bir artış göstermelidir. İnhibe edilmiş alt örnekler ideal olarak düz bir çizgi veya biraz artan bir eğim gösterir (Şekil 3). İnhibe edilmiş alt örneklerden eğimler, inhibe edilmemiş alt numunelerden çıkarılmalıdır. Her i…

Discussion

Bu protokol, kısmen bölümlere ayrılmış CoQ havuzlarının varlığını tanımlamak için çok basit bir prosedürü temsil etse de, dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. Substratlar (yani, NADH veya süksinat), bu bileşiklerin otooksidasyonu meydana gelebileceğinden, tercihen en son eklenir. Cuvette’in çevirmesi, okumaya müdahale edebilecek kabarcıkların oluşumunu önlemek için dikkatli olmalıdır.

Ek olarak, mevcut teknik, bahsetmeye değer birkaç sınırla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Teknik yardım için Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez ve E. R. Martínez-Jimenez’e teşekkür ederiz. Bu çalışma MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ve HFSP (RGP0016/2018) tarafından desteklenmiştir. CNIC, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezidir (SEV-2015-0505). Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 10775835001
Bradford protein assay Bio-Rad 5000001
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KCl Sigma-Aldrich P3911
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NADH Roche 10107735001
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 207810
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Spectra Manager software JASCO version 2
Spectrophotometer UV/VISJASCO
Succinate Sigma-Aldrich 398055
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
  2. Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
  3. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  4. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  5. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
  6. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  7. Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
  8. Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
  9. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
  10. Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
  11. Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
  12. Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
  13. Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
  14. Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
  15. Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
  16. Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
  17. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  18. Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
  19. Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
  20. Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
  21. Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
  22. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
  23. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  24. Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
  25. Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
  26. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  27. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  28. den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
  29. Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
  30. Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
  31. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
  32. Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
  33. Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).

Tags

Na+ SensitivityMitochondrial MembraneCoQ PoolsElectron TransferLipid DropsCytochrome CMalonateRotenoneNADHAntimycin ASuccinate
check_url/63729?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hernansanz-Agustín, P., Enríquez, J. A. Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools. J. Vis. Exp. (185), e63729, doi:10.3791/63729 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image