Summary
Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.
Abstract
As piscinas de ubiquinona (CoQ) na membrana mitocondrial interna (IMM) são parcialmente segmentadas para enzimas complexas I ou dependentes de FAD. Tal subdivisão pode ser facilmente avaliada por um ensaio comparativo usando NADH ou succinato como doadores de elétrons em mitocôndrias descongeladas congeladas, nas quais a redução do citocromo c (cyt c) é medida. O ensaio se baseia no efeito de Na+ no IMM, diminuindo sua fluidez. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade naDH-cyt c oxidoreductase e atividades de succinato-cyt c oxidoreductase na presença de NaCl ou KCl. As reações, que dependem da mistura de reagentes em uma cuvette de forma stepwise, são medidas espectrofotometricamente durante 4 minutos na presença de Na+ ou K+. A mesma mistura é realizada em paralelo na presença dos inibidores específicos da enzima, a fim de subtrair a alteração inespecífica na absortância. A atividade nadh-cyt c oxidoreductase não diminui na presença de nenhuma dessas alcaações. No entanto, a atividade de succinato-cyt c oxidoreductase diminui na presença de NaCl. Este simples experimento destaca: 1) o efeito de Na+ na diminuição da fluidez do IMM e da transferência de CoQ; 2) que o supercomplexO I+III2 protege a transferência de ubiquinona (CoQ) de ser afetada pela redução da fluidez do IMM; 3) que a transferência de CoQ entre CI e CIII é funcionalmente diferente da transferência de CoQ entre CII e CIII. Esses fatos sustentam a existência de piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM e mostram que podem ser reguladas pelo ambiente Na+ em mudança das mitocôndrias.
Introduction
O sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é a principal via que conduz a síntese de triptosfato de adenosina (ATP), a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o consumo de equivalentes redutores, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ou succinato, por mitocôndrias. O sistema OXPHOS é composto por cinco complexos proteicos: Complexo I (CI) oxida NADH e reduz o CoQ em ubiquinol (CoQH2). O Complexo II (CII) oxida o succinato em fumarate e reduz o CoQ em CoQH2. Complexo III (CIII) oxida CoQH2 de volta ao CoQ, reduzindo citocromo c (cyt c). Finalmente, o complexo IV (CIV) oxida o cit c e reduz o oxigênio à água. Esta cadeia de oxidoredução, a chamada cadeia de transporte de elétrons (mETC), é acoplada ao bombeamento de H+ através do IMM, que cria um gradiente eletroquímico usado pelo complexo V (CV) para fosfortar difosfato de adenosina (ADP) em ATP.
os complexos mETC podem estar sozinhos no IMM ou montar em estruturas quaternárias chamadas supercomplexos. O CIV pode montar com CIII, formando o III2+IV ou Q-respirasome (como é capaz de respirar na presença de CoQH2)1,2,3 ou formando homodimers ou homooligomers4. O CIII pode interagir com a CI, formando o supercomplexo I+III25. Finalmente, a CI também é capaz de interagir com o Q-respirasome, construindo o I+III2+IV ou N-respirasome (pois pode respirar consumindo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c são portadores de elétrons móveis encarregados da transferência de elétrons de CI/CII para CIII, e de CIII para CIV, respectivamente. Se os supercomplexos impõem ou não uma restrição local funcional para essas operadoras tem sido uma questão de intenso debate ao longo das últimas duas décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, vários grupos independentes demonstraram que o CoQ e o cyt c podem ser segmentados funcionalmente em piscinas no IMM. Em relação ao CoQ, ele pode ser segmentado funcionalmente em um pool específico de CoQ para CI (CoQNAD) e outro pool dedicado às enzimas dependentes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. No entanto, para diferenciar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas, foram necessárias a superexpressão da oxidase alternativa (AOX) e a geração de mutantes específicos de MTDNA, que podem montar IC na ausência de CIII, foram necessários 1,19,20.
O mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a hipóxia era desconhecido até recentemente. Após a hipóxia aguda, a IC sofre a transição ativa/deativa (A/D), que envolve a diminuição de sua atividade de oxidoreductase de bombeamento H+ . Tal diminuição no bombeamento H+ acidifica a matriz mitocondrial e dissolve parcialmente os precipitados de cálcio-fosfato na matriz mitocondrial, liberando ca2+solúvel. Esse aumento no Ca2+ solúvel ativa o trocador Na+/Ca2+ (NCLX), que extrude o Ca2+ em troca de Na+. Mitocondrial Na+ o aumento interage com fosfolipídios no lado interno do IMM, diminuindo sua fluidez e transferência de CoQ entre CII e CIII, finalmente produzindo ânion de superóxido, um sinal de redox21. Curiosamente, a transferência de CoQ só foi diminuída entre CII e CIII, mas não entre CI e CIII, destacando que 1) Na+ foi capaz de modular apenas uma das piscinas coq existentes nas mitocôndrias; 2) existem piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM. Assim, um protocolo amplamente utilizado para o estudo de atividades enzimárias mitocondriais pode ser utilizado para avaliar a existência das piscinas coq mencionadas.
O protocolo atual baseia-se na medição da redução do cit c oxidado, o substrato do CIII, por absorção na presença de succinato (ou seja, substrato CII) ou NADH (ou seja, substrato ci). A mesma amostra é dividida em duas, uma das quais será tratada com LCI, e a outra com a mesma concentração de NaCi. Dessa forma, dado que o Na+ diminui a fluidez do IMM, se o CoQ existisse em um pool único no IMM, tanto CI+CIII quanto CII+CIII diminuiriam na presença de Na+. No entanto, se o CoQ existisse em pools de CoQ funcionais parcialmente segmentados, o efeito de Na+ seria evidente principalmente (ou apenas) sobre a atividade CII+CIII, mas não no CI+CIII. Como publicado recentemente21, Na+ afeta apenas a transferência de CoQ entre CII e CIII (Figura 1C,D), mas não entre CI e CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, juntamente com uma panóplia de técnicas, tem sido utilizado para confirmar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas no IMM, uma dedicada à CI (ou seja, CoQNAD), e outra dedicada às enzimas ligadas à FAD (ou seja, CoQFAD)1,3,7; observação que, embora continue a ser debatida22, foi corroborada independentemente por vários grupos 7,19. Assim, a supermontagem da CI em supercomplexos impacta na mobilidade local do CoQ, facilitando seu uso pelo CIII dentro do supercomplexo 1,7,13,14,23,24,25.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de ética institucional do Centro Nacional de Investigações Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espanha, de acordo com a Diretiva da União Europeia de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) e com o Decreto Real Espanhol de 1 de fevereiro de 2013 (53/2013). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.
NOTA: Este ensaio comparativo para estudar a segmentação de piscinas de CoQ mitocondrial é descrito da seguinte forma:
1. Quantificação de proteínas
- Congele e descongele as mitocôndrias isoladas26 de um fígado de camundongo tipo selvagem três vezes (ou seja, membranas mitocondriais) antes da experimentação para tornar as organelas permeáveis aos substratos de reação.
- Quantifique a quantidade proteica da amostra isolada de mitocôndrias pelos métodos de Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA). No caso de Bradford, adicione 2 μL de amostra em 1 mL de reagente 1x Bradford.
- Divida a amostra em quatro subsampleas de 20 μg cada (a: A, B, C, D; Figura 2A).
2. Medição da atividade CI+CIII
NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras A e B para medir a atividade CI+CIII (Figura 2B).
- Divida as amostras A e B em duas subamostras de 10 μg cada (a1, A2, B1 e B2). Misture cada uma das subamplegas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 10 μL de malonato de 100 mM e adicione tampão C1/C2 pré-aquecido (Tabela 1) a 37 °C até 980 μL (979 μL para cuvettes A2 e B2).
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos malonato e cianeto de potássio.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K2HPO4 solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento. - Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas A1 e A2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas B1 e B2.
- Adicione 1 μL de rotenona de 1 mM na cuvette contendo subsames A2 e B2.
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso do reagente tóxico rotenona. - Logo antes da medição, adicione 10 μL de NADH (10 mM) em todas as cuvetas.
NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura. - Misture a cuvette girando-a cuidadosamente três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrofotômetro UV/VISJASCO).
- Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.
- No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.
3. Medindo a atividade CII+CIII
NOTA: Esta parte do protocolo utiliza as amostras C e D para medir a atividade CII+CIII (Figura 2C).
- Divida as amostras C e D em duas subamostras de 10 μg cada (ou seja, C1, C2, D1 e D2). Misture cada uma das subamplenas em um cuvette de 1 mL com 30 μL de cyt c (10 mg/mL), 1 μL de rotenona de 1 mM e adicione o tampão C1/C2 pré-aquecido a 37 °C até 980 μL (970 μL para cuvettes C2 e D2).
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso dos reagentes tóxicos cianeto de potássio e rotenona.
NOTA: cyt c (10 mg/mL) deve ser preparado fresco misturando 10 mg de cit c em 1 mL de 10 mM K2HPO4 solução, pH ajustado para 7,2, e deve ser mantido em gelo durante todo o experimento. - Adicione 10 μL de 1 M KCl nas cuvetas C1 e C2, e adicione 10 μL de 1 M NaCl nas cuvetas D1 e D2.
- Adicione 1 μL de 1 mM de antimicina A na cuvette contendo subsames C2 e D2.
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o uso da antimicina de reagente tóxico A. - Logo antes da medição, adicione 10 μL de succinato (1 M) em todas as cuvetas.
NOTA: O 10 μL é de preferência adicionado no degrau da cuvette, de modo que a reação começa após a mistura. - Misture a cuvette com cuidado, virando-a três vezes. Coloque-o no leitor de cuvette de absorção (espectrômetro UV/VIS).
- Clique em Measure > Parâmetros > Geral e defina os parâmetros de medição em Comprimento de Onda: 550 nm e Tempo: 4 minutos de leitura; pressione os botões Aceitar e Iniciar para iniciar o experimento.
- No final da medição, salve a inclinação que compreende o aumento linear da absorvância clicando em Arquivo e Salve As. A inclinação também pode ser coletada manualmente.
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Representative Results
Os resultados típicos deste protocolo estão representados abaixo (Figura 3). Como a absorvência c reduzida se localiza a 550 nm, todas as subsampeções desinibidas devem mostrar um aumento na absorvância de 550 nm. Subsamples inibidas, o ideal é mostrar uma inclinação plana ou ligeiramente crescente (Figura 3). As encostas de subsamtras inibidas devem ser subtraídas de subsampleções desinibidas.
As amostras A e B, ambas corrigidas por sua inibição correspondente e que representam a atividade nadh:cyt c oxidoreductase, possuem inclinação semelhante (Figura 3A). No entanto, as subsames C e D, ambas corrigidas pela inibição correspondente e que representam a atividade succinato:cyt c oxidoreductase, são diferentes, na qual a atividade de subsample C é maior do que a atividade da subsample D (Figura 3B). Observe que a absorção basal pode ser ligeiramente diferente entre as amostras (Figura 3A).
Esses resultados (ou seja, encostas já corrigidas pelo seu inibidor; Tabela 2) pode ser representado dividindo a quantidade de proteína utilizada (0,01 mg) como proteína a.u./min/mg. A partir desse valor, a taxa de redução do cyt c pode ser calculada ainda mais usando a lei Lamber-Beer21.
É importante ressaltar que esses resultados podem variar de acordo com vários fatores: (i) Origem das amostras. Dado que diferentes tecidos e tipos celulares possuem uma composição variável de complexos oxphos e supercomplexos, valores absolutos e alterações relativas podem variar entre as amostras. (ii) Dado que diferentes tecidos podem ter uma composição variável de complexos oxphos e supercomplexos, adicionando mais mitocôndrias descongeladas congeladas (para compensar valores absolutos mais baixos de um determinado tecido) à mistura de reação pode ter um efeito secundário, que é que a razão de Na+ ou K+ por mg de proteína/fosfolipídid na amostra diminui. Assim, deve-se ter cuidado ao variar a quantidade de mitocôndrias ou a concentração na+/K+ adicionada à amostra. (iii) A variação interexperimental pode surgir da duração e temperatura dos ciclos de congelamento, do lote comercial dos reagentes ou do buffer de armazenamento variável de mitocôndrias isoladas.
Figura 1: Na+ diminui especificamente a transferência de elétrons entre CII e CIII, mas não entre CI e CIII. (A) Representação esquemática da transferência de elétrons entre NADH e cyt c, ocorrendo através do CoQNAD no supercomplexO I+III2. (B) A transferência de elétrons entre NADH e cyt c, ocorrendo através do CoQNAD no supercomplexo I+III2, não é afetada pelo Na+intramitocondrial. (C) Representação esquemática da transferência de elétrons entre o succinato e o ct c, ocorrendo através doCoQ FAD em CII. (D) A transferência de elétrons entre NADH e cyt c, ocorrendo através do CoQFAD no supercomplexo I+III2, é diminuída por na+intramitocondrial elevado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática do protocolo desde a subdivisão da amostra original até a medição cinética. (A) Representação esquemática da divisão subsample, destacando a mesma origem de todas as subsampleções. (B) Esquema das sucessivas etapas das adições do reagente para a atividade CI+CIII nas subsames A1 e B1. O círculo vermelho representa o local onde o NADH deve ser adicionado idealmente. Note que a única diferença com subamostras A2 e B2 é a adição extra de rotenone no último. (C) Esquema das sucessivas etapas das adições do reagente para a atividade CII+CIII nas subsames C1 e D1. O círculo vermelho representa o local onde o succinato deve ser adicionado idealmente. Note que a única diferença com subamostras C2 e D2 é a adição extra de antimicina A neste último. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito de Na+ na redução de cyt c por membranas mitocondriais hepáticas de camundongos sobre nadh ou adição de succinato. (A) Traços representativos mostrando o efeito de Na+ na redução de cyt c por membranas mitocondriais hepáticas de camundongos oxidando NADH. (B) Traços representativos mostrando o efeito de Na+ na redução de cyt c por membranas mitocondriais hepáticas de camundongos oxidantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composto | Concentração |
| K2HPO4 | 25 mM |
| MgCl2 | 5 mM |
| KCN | 3 mM |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 2,5 mg/mL |
Tabela 1: Composição do tampão C1/C2. A composição do buffer é apresentada em concentrações molares.
| Taxas esperadas | +KCl (Média) | +KCl (SD) | +NaCl (Média) | +NaCl (SD) | Valor de Mann-Whitney P |
| CII + CIII (n = 4) | 0.050659 | 0.0068377 | 0.023217 | 0.0024511 | 0.0286 |
| Valores individuais | 0.0509629 | 0.02250151 | |||
| 0.0561086 | 0.02664035 | ||||
| 0.0393956 | 0.01984683 | ||||
| 0.0561695 | 0.0238827 | ||||
| CI + CIII (n = 4) | 0.016681 | 0.00237326 | 0.017756 | 0.0029472 | 0.4857 |
| Valores individuais | 0.01610133 | 0.01780299 | |||
| 0.01878711 | 0.01901848 | ||||
| 0.01303777 | 0.01308397 | ||||
| 0.01879871 | 0.02112066 | ||||
Tabela 2: As taxas esperadas variam. Os valores esperados para cada atividade são apresentados em unidades arbitrárias. O teste estatístico correspondente entre +KCl e +NaCl também é apresentado. "n" representa o número de réplicas.
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Discussion
Embora este protocolo represente um procedimento muito simples para identificar a existência das piscinas de CoQ parcialmente segmentadas, existem algumas medidas críticas a serem tomadas em conta. Substratos (ou seja, NADH ou succinato) são preferencialmente adicionados por último, uma vez que a autooxidação desses compostos pode ocorrer. A inversão de Cuvette deve ter cuidado para evitar a formação de bolhas que possam interferir na leitura.
Além disso, a presente técnica apresenta algumas limitações que merecem ser mencionadas. As medidas não são realizadas em mitocôndrias intactas. Assim, o conteúdo artificial e a proporção do buffer podem resultar em diferenças com o ambiente nativo das mitocôndrias.
Os reagentes são adicionados em excesso, e podem não representar a verdadeira disponibilidade de substratos em tecidos intactos.
Os métodos atuais implicam a geração e o uso de modelos genéticos e equipamentos genéticos muito específicos que não estão prontamente disponíveis em muitos laboratórios1. Este protocolo fornece um método confiável e fácil de fazer para medir a existência das piscinas de CoQ parcialmente diferenciadas usando reagentes e ferramentas amplamente disponíveis. Assim, é possível que possa ser aplicado em estudos futuros comparando modelos genéticos da doença mitocondrial.
A mobilidade dos transportadores de elétrons móveis no mETC ainda é um tema altamente debatido25,27, embora a existência de piscinas parcialmente diferenciadas esteja se tornando aceita 7,12,18,28,29. Recentemente, a respirometria de alta resolução e a caracterização bioquímica detalhada de vários mutantes oxphos expressando AOX1, juntamente com estudos refinados de microscopia crioelétrica preservando o meio lipídico natural7, trouxeram luz à discussão. Isso coloca argumentos pesados a favor da existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.
Além disso, os estímulos fisiológicos têm se mostrado regulados pelas diferentes piscinas de CoQ; em particular, a resposta hipóxica aguda impulsionada por Na+intramitocondrial. Níveis mais altos de Na+ em mitocôndrias durante a hipóxia diminuem a transferência de elétrons entre CII e CIII, desacoplamento do ciclo Q ao nível de CIII e produzindo um ânion de superóxido. Em contraste, a transferência de elétrons entre CI e CIII não diminuiu21. O protocolo atual explica extensivamente o procedimento pelo qual esses resultados foram obtidos.
Outros controles podem ser aplicados ao protocolo atual se o tratamento em estudo for realizado em cellule ou in vivo, que são as atividades complexas isoladas de IC, CII e CIII, pois suas quantidades individuais ou atividades individuais podem variar junto com o tratamento. Após um procedimento muito semelhante descrito acima, não foram observadas diferenças em nenhuma dessas atividades isoladas21 na presença ou ausência de Na+. Note-se que foi descrito que o Na+ pode aumentar a transição D/A30. No entanto, o protocolo utilizado nesta observação envolveu o uso de partículas subocondriais (SMPs), enquanto nosso protocolo utiliza membranas mitocondriais, destacando a necessidade do potencial de membrana em todo o IMM para o efeito contabilizado30.
Deve-se notar que os ciclos de congelamento não dissolvem as membranas como os detergentes, assim, complexos únicos e supercomplexos ainda estão ligados a bicamadas fosfolipídas. Isso é evidenciado pelo fato de que o consumo de oxigênio mitocôndrias descongelada congelada através de CI ou CII pode ser medido na presença de citocromo c31. Além disso, se houvesse um efeito dos ciclos de congelamento na atividade CII+CIII, ele não seria visto apenas em amostras de "NaCl 10 mM", mas também em amostras "KCl 10 mM". Isso tornaria a medição impossível (já que o CII seria separado do CIII através da decomposição da membrana) ou inferior a um ponto em que as diferenças entre K+ e Na+ não seriam vistas. No entanto, como visto na Figura 2B, este não é o caso. A adição de KCl no protocolo é projetada para descartar possíveis efeitos da osmolaridade ou da força iônica nas atividades medidas. A osmolaridade final em ambos os casos, a amostra "10 mM KCl" e a amostra "10 mM NaCl", é igual (116 mEq/L) e a única diferença entre as amostras é a presença de 10 mM K+ ou 10 mM Na+. No entanto, se os cations K+ do buffer tivessem um efeito, ele se manifestaria tanto nas amostras "KCl 10 mM" quanto em "NaCl 10 mM", tornando tal efeito indiscernível em ambas as amostras.
Na capacidade dos diferentes cáras de ligar fosfolipídios, o que é de fato crucial é a química de coordenação e o raio iônico de cada cáção (como destacado experimentalmente em nosso artigo original21, e teoricamente em Böckmann et al.32). Enquanto o K+ apresenta um número médio de coordenação de seis, o número médio de coordenação na+ é cinco, resultando em uma geometria complexa de coordenação diferente, que se traduz em efeitos muito diferentes de K+ e Na+ em uma bicamada fosfolipídid33.
Deve-se notar também que o raio iônico de K+ e Na+ são diferentes. Enquanto k+ tem um raio iônico de 280 pm, Na+ tem um raio iônico de 227 pm. Essa diferença impacta diretamente em sua interação com ânions (ou zwitterions), uma vez que um raio iônico mais baixo (ou seja, menos conchas de elétrons) resulta em uma interação mais forte com uma molécula negativamente carregada, pois o núcleo iônico positivo é mais exposto como se tivesse conchas eletrônicas extras (ou seja, raio iônico mais alto). De fato, todos os cations são possivelmente capazes de interagir com fosfolipídios; no entanto, apenas aqueles com propriedades químicas-físicas específicas são capazes de ter efeitos específicos em uma bicamadas fosfolipídida, como Na+.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado pelo MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). O CNIC conta com o apoio do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), do Ministério da Ciencia, da Innovación e das Universidades (MCNU) e da Fundação Pró CNIC e do Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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