线粒体内膜对Na+ 的敏感性揭示了部分分割的功能性辅酶Q库

Summary

该协议描述了一种比较测定，在存在或不存在Na ⁺的情况下使用线粒体复合物活性CI + CIII和CII + CIII，以研究部分分段功能CoQ池的存在。

Abstract

线粒体内膜（IMM）中的泛醌（CoQ）池部分分割为复合I或FAD依赖性酶。这种细分可以很容易地通过使用NADH或琥珀酸盐作为冷冻解冻线粒体中的电子供体的比较测定来评估，其中测量细胞色素c（cyt c）减少。该测定依赖于Na ⁺ 对IMM的影响，从而降低其流动性。在这里，我们提出了一种方案，用于在NaCl或KCl存在下测量NADH-cyt c氧化还原酶活性和琥珀酸-细胞c氧化还原酶活性。反应依赖于比色皿中试剂的混合物，在Na ⁺ 或K ⁺存在下在4分钟内进行分光光度法测量。在特定酶抑制剂存在下平行进行相同的混合物，以减去吸光度的非特异性变化。NADH-cyt c氧化还原酶活性在任何这些阳离子的存在下都不会降低。然而，琥珀酸细胞c氧化还原酶活性在NaCl存在下降低。这个简单的实验突出了：1）Na ⁺ 在降低IMM流动性和CoQ转移方面的作用;2）超复合物I + III₂ 保护泛醌（CoQ）转移免受降低IMM流动性的影响;3）CI和CIII之间的CoQ转移在功能上不同于CII和CIII之间的CoQ转移。这些事实支持了IMM中存在功能分化的辅酶Q池，并表明它们可以受到线粒体不断变化的Na ⁺ 环境的调节。

Introduction

线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）是线粒体驱动三磷酸腺苷（ATP）合成，活性氧（ROS）产生和消耗还原当量（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或琥珀酸盐）的主要途径。OXPHOS系统由五种蛋白质复合物组成：复合物I（CI）氧化NADH并将CoQ还原成泛醇（CoQH₂）。复合物II（CII）将琥珀酸盐氧化成富马酸盐，并将辅酶Q还原成CoQH₂。复合物III（CIII）将CoQH₂ 氧化回CoQ，减少细胞色素c（cyt c）。最后，复合物IV（CIV）氧化cyt c并将氧气还原为水。这种氧化还原链，即所谓的电子传递链（mETC），耦合到H ⁺ 泵浦过IMM，从而产生复合物V（CV）使用的电化学梯度，将磷酸腺苷二磷酸（ADP）转化为ATP。

mETC配合物可以在IMM中单独存在，也可以组装成称为超复合物的四元结构。CIV可以与CIII组装，形成III₂ + IV或Q-呼吸体（因为它能够在CoQH₂存在下呼吸）^1，2，3 或形成同源二聚体或同源物⁴。CIII可以与CI相互作用，形成超复杂I + III₂⁵。最后，CI还能够与Q-呼吸体相互作用，建立I + III₂ + IV或N-呼吸体（因为它可以呼吸消耗NADH）^{1，6，7，8，9，10}。

CoQ和cyt c是移动电子载体，分别负责将电子从CI / CII转移到CIII，以及从CIII转移到CIV。超复合物是否对这些载体施加功能局部限制在过去二十年中一直是一个激烈争论的问题^2，7，^{11，12，13，14，15，16，17}。然而，几个独立的小组已经证明，CoQ和cyt c可以在功能上分割成IMM中的池。在辅酶Q方面，它可以在功能上细分为CI的特定辅酶Q池（CoQ^NAD）和另一个专用于FAD依赖性酶（CoQ^FAD）^{的池1，7，12，18，19}。然而，为了区分部分分割的功能性CoQ池的存在，需要替代氧化酶（AOX）的过表达和在没有CIII的情况下可以组装CI的特定mtDNA突变体的产生^1，19，20。

缺氧期间活性氧（ROS）产生的机制直到最近才为人所知。在急性缺氧时，CI经历活性/去活性（A / D）转变，这涉及其H ⁺ 泵送NADH-CoQ氧化还原酶活性的降低。H⁺ 泵送的这种减少使线粒体基质酸化，并部分溶解线粒体基质中的磷酸钙沉淀物，释放可溶性Ca^{2 +}。可溶性Ca^{2 +} 的这种增加激活Na ⁺ / Ca^{2 +} 交换器（NCLX），其挤出Ca^{2 +} 以换取Na ⁺。线粒体Na⁺ 增加与IMM内侧的磷脂相互作用，降低其流动性和CII和CIII之间的CoQ转移，最终产生超氧阴离子，氧化还原信号²¹。有趣的是，CoQ转移仅在CII和CIII之间减少，但在CI和CIII之间没有减少，这突出表明1）Na ⁺ 只能调节线粒体中现有的一个CoQ池;2）IMM中存在功能差异化的辅酶Q池。因此，用于研究线粒体酶活性的广泛使用的方案可用于评估所提到的CoQ池的存在。

目前的方案是基于通过琥珀酸盐（即CII底物）或NADH（即CI底物）存在下的吸光度来测量氧化cyt c（CIII的底物）的还原。将相同的样品分为两个，其中一个用KCl处理，另一个用相同浓度的NaCl处理。这样，鉴于Na ⁺ 降低了IMM的流动性，如果CoQ存在于IMM中的独特池中，则在Na ⁺存在的情况下，CI + CIII和CII + CIII都将降低。然而，如果CoQ存在于部分分段的功能CoQ池中，Na ⁺ 对CII + CIII活性的影响将大部分（或仅）明显，但对CI + CIII的影响则不明显。正如最近发表的²¹，Na ⁺ 仅影响CII和CIII之间的CoQ转移（图1C，D），但不影响CI和CIII之间的CoQ转移（图1A，B）。

该协议与一系列技术一起，已被用于确认IMM中存在部分分段的功能性CoQ池，一个专用于CI（即CoQ^NAD），另一个专用于FAD连接的酶（即CoQ^FAD）^1，3，7;一个观察结果，虽然它继续争论²²，但已被几个团体独立证实^7，19。因此，CI的超复合体分解会影响CoQ的局部移动性，促进CIII在超复合物1^，7，^{13，14，23，24，25}中的使用。

Protocol

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到西班牙卡洛斯三世心血管研究中心（CNIC）机构伦理委员会的批准，符合2010年9月22日的欧盟指令（2010/63/UE）和2013年2月1日的西班牙皇家法令（53/2013）。我们尽一切努力尽量减少使用的动物数量及其痛苦。 注意：该研究线粒体CoQ池分割的比较测定描述如下： 1. 蛋白质定量 ?…

Representative Results

该协议的典型结果如下所示（图3）。由于降低的cyt c吸光度位于550nm处，因此所有未抑制的子样品必须在550nm处显示吸光度增加。理想情况下，抑制的子样本显示平坦或略微增加的斜率（图3）。从不受抑制的子样本中减去来自抑制子样本的斜率。 样品A和B都通过其对应抑制物校正并且代表NADH：cyt c氧化还原酶活性，具有相似的斜率?…

Discussion

虽然该协议代表了识别部分分段的CoQ池存在的非常简单的过程，但有几个关键步骤需要考虑。底物（即NADH或琥珀酸盐）优选最后加入，因为这些化合物可能发生自氧化。比色皿的翻转必须小心，以避免形成可能干扰读数的气泡。

此外，本技术还存在一些值得一提的局限性。测量不是在完整的线粒体中进行的。因此，人工缓冲液的含量和比例可能导致与线粒体的天然环境的差?…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	10775835001
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000001
Cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C7752
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Malonic acid	Sigma-Aldrich	M1296
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
Potassium cyanide	Sigma-Aldrich	207810
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Spectra Manager software	JASCO	version 2
Spectrophotometer	UV/VISJASCO
Succinate	Sigma-Aldrich	398055