Innere Empfindlichkeit der mitochondrialen Membran gegenüber Na+ zeigt teilweise segmentierte funktionelle CoQ-Pools
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen vergleichenden Assay, der mitochondriale komplexe Aktivitäten CI+CIII und CII+CIII in Gegenwart oder Abwesenheit von Na+ verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu untersuchen.
Abstract
Ubichinon (CoQ) -Pools in der inneren mitochondrialen Membran (IMM) sind teilweise zu komplexen I- oder FAD-abhängigen Enzymen segmentiert. Eine solche Unterteilung kann leicht durch einen vergleichenden Assay mit NADH oder Succinat als Elektronendonatoren in gefroren-aufgetauten Mitochondrien beurteilt werden, in denen die Reduktion von Cytochrom c (Cyt c) gemessen wird. Der Assay stützt sich auf die Wirkung von Na+ auf das IMM und verringert seine Fließfähigkeit. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der NADH-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivität und der Succinat-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivitäten in Gegenwart von NaCl oder KCl vor. Die Reaktionen, die schrittweise auf die Mischung von Reagenzien in einer Küvette angewiesen sind, werden spektralphotometrisch während 4 min in Gegenwart von Na+ oder K+ gemessen. Die gleiche Mischung wird parallel in Gegenwart der spezifischen Enzyminhibitoren durchgeführt, um die unspezifische Absorptionsänderung abzuziehen. Die Aktivität der NADH-cyt-c-Oxidoreduktase nimmt in Gegenwart eines dieser Kationen nicht ab. Die Aktivität der Succinat-c-Oxidoreduktase nimmt jedoch in Gegenwart von NaCl ab. Dieses einfache Experiment hebt hervor: 1) die Wirkung von Na + bei der Verringerung der IMM-Fließfähigkeit und des CoQ-Transfers; 2) dass der Superkomplex I+III 2 den Ubichinon-Transfer (CoQ) davor schützt, durch eine Verringerung der IMM-Fließfähigkeit beeinträchtigt zu werden; 3) dass sich die CoQ-Übertragung zwischen CI und CIII funktionell von der CoQ-Übertragung zwischen CII und CIII unterscheidet. Diese Tatsachen unterstützen die Existenz funktional differenzierter CoQ-Pools im IMM und zeigen, dass diese durch die sich verändernde Na+-Umgebung der Mitochondrien reguliert werden können.
Introduction
Das mitochondriale oxidative Phosphorylierungssystem (OXPHOS) ist der Hauptweg, der die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP), die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den Verbrauch von reduzierenden Äquivalenten wie Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) oder Succinat durch Mitochondrien antreibt. Das OXPHOS-System besteht aus fünf Proteinkomplexen: Komplex I (CI) oxidiert NADH und reduziert CoQ in Ubiquinol (CoQH2). Komplex II (CII) oxidiert Succinat zu Fumarat und reduziert CoQ in CoQH2. Komplex III (CIII) oxidiertCoQH 2 wieder zu CoQ und reduziert Cytochrom c (Cyt c). Schließlich oxidiert Komplex IV (CIV) Cyt c und reduziert Sauerstoff zu Wasser. Diese Oxidoreduktionskette, die sogenannte Elektronentransportkette (mETC ), ist an das Pumpen von H+ über das IMM gekoppelt, wodurch ein elektrochemischer Gradient erzeugt wird, der vom Komplex V (CV) verwendet wird, um Adenosindiphosphat (ADP) zu ATP zu phosphorylieren.
mETC-Komplexe können entweder allein im IMM sein oder sich zu quartären Strukturen zusammensetzen, die als Superkomplexe bezeichnet werden. CIV kann sich mit CIII zusammensetzen, indem es das III 2 + IV- oder Q-Respirasom bildet (da es in Gegenwart von CoQH 2) 1,2,3 atmen kann oder Homodimere oder Homooligomere4 bildet. CIII kann mit CI interagieren und bildet den Superkomplex I+III25. Schließlich ist CI auch in der Lage, mit dem Q-Respirasom zu interagieren und das I + III2 + IV- oder N-Respirasom zu bauen (da es NADH verbrauchen kann) 1,6,7,8,9,10.
CoQ und cyt c sind mobile Elektronenträger, die für die Übertragung von Elektronen von CI/CII auf CIII bzw. von CIII auf CIV verantwortlich sind. Ob Superkomplexe eine funktionelle lokale Einschränkung für diese Träger darstellen oder nicht, wurde in den letzten zwei Jahrzehntenintensiv diskutiert 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Mehrere unabhängige Gruppen haben jedoch gezeigt, dass CoQ und cyt c im IMM funktional in Pools segmentiert werden können. In Bezug auf das CoQ kann es funktional in einen spezifischen CoQ-Pool für CI (CoQNAD) und einen weiteren Pool für FAD-abhängige Enzyme (CoQFAD) 1,7,12,18,19 unterteilt werden. Um jedoch die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu unterscheiden, waren die Überexpression der alternativen Oxidase (AOX) und die Erzeugung spezifischer mtDNA-Mutanten, die CI in Abwesenheit von CIII zusammensetzen können,erforderlich 1,19,20.
Der Mechanismus der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) während der Hypoxie war bis vor kurzem unbekannt. Bei akuter Hypoxie durchläuft CI den aktiven/deaktiven (A/D) Übergang, bei dem die H+-Pump-NADH-CoQ-Oxidoreduktase-Aktivität abnimmt. Eine solche Abnahme des H+-Pumpens säuert die mitochondriale Matrix an und löst die Calcium-Phosphat-Ausscheidungen in der mitochondrialen Matrix teilweise auf, wobei lösliches Ca2 + freigesetzt wird. Dieser Anstieg des löslichen Ca 2+ aktiviert den Na+/Ca 2+ Wärmetauscher (NCLX), der Ca 2+ im Austausch gegen Na+ extrudiert. Der mitochondriale Na+-Anstieg interagiert mit Phospholipiden in der Innenseite des IMM, verringert seine Fließfähigkeit und den CoQ-Transfer zwischen CII und CII und erzeugt schließlich Superoxid-Anion, ein Redoxsignal21. Interessanterweise war der CoQ-Transfer nur zwischen CII und CII vermindert, aber nicht zwischen CI und CIII, was hervorhebt, dass 1) Na+ nur einen der vorhandenen CoQ-Pools in den Mitochondrien modulieren konnte; 2) es gibt funktional differenzierte CoQ-Pools im IMM. So kann ein weit verbreitetes Protokoll zur Untersuchung mitochondrialer Enzymaktivitäten verwendet werden, um die Existenz der genannten CoQ-Pools zu beurteilen.
Das aktuelle Protokoll basiert auf der Messung der Reduktion von oxidiertem Cyt c, dem Substrat von CIII, durch Absorption in Gegenwart von Succinat (d.h. CII-Substrat) oder NADH (d.h. CI-Substrat). Die gleiche Probe wird in zwei geteilt, von denen eine mit KCl und die andere mit der gleichen Konzentration von NaCl behandelt wird. Auf diese Weise, da Na + die IMM-Fluidität verringert, würden sowohl CI+CIII als auch CII+CIII in Gegenwart von Na+ abnehmen, wenn CoQ in einem einzigartigen Pool im IMM vorhanden wäre. Wenn CoQ jedoch in teilweise segmentierten funktionalen CoQ-Pools vorhanden wäre, wäre die Wirkung von Na+ hauptsächlich (oder nur) auf die CII+CIII-Aktivität offensichtlich, nicht jedoch auf die CI+CIII. Wie kürzlich veröffentlicht21, betrifft Na+ nur den CoQ-Transfer zwischen CII und CIII (Abbildung 1C,D), nicht aber zwischen CI und CIII (Abbildung 1A,B).
Dieses Protokoll wurde zusammen mit einer Reihe von Techniken verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools im IMM zu bestätigen, von denen einer für CI (dh CoQNAD) und ein anderer für FAD-verknüpfte Enzyme (dh CoQFAD) bestimmt ist)1,3,7; Eine Beobachtung, die, obwohl sie weiterhin diskutiert wird22, von mehreren Gruppen unabhängig voneinander bestätigtwurde 7,19. So wirkt sich die Superassemblierung von CI zu Superkomplexen auf die lokale Mobilität von CoQ aus und erleichtert seine Verwendung durch das CIII innerhalb des Superkomplexes 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl dieses Protokoll ein sehr einfaches Verfahren darstellt, um die Existenz der teilweise segmentierten CoQ-Pools zu identifizieren, gibt es einige kritische Schritte, die berücksichtigt werden müssen. Substrate (d. h. NADH oder Succinat) werden vorzugsweise zuletzt zugegeben, da eine Autooxidation dieser Verbindungen auftreten kann. Das Umdrehen der Küvette muss vorsichtig sein, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die das Lesen beeinträchtigen können.
Darüber hinaus weist die vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez und E. R. Martínez-Jimenez für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt von MICIN: RTI2018-099357-B-I00 und HFSP (RGP0016/2018). Das CNIC wird vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Abbildung 2 erstellt mit BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
