La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati
Summary
Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l’esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.
Abstract
I pool di ubichinone (CoQ) nella membrana mitocondriale interna (IMM) sono parzialmente segmentati in enzimi del complesso I o FAD-dipendenti. Tale suddivisione può essere facilmente valutata mediante un saggio comparativo che utilizza NADH o succinato come donatori di elettroni nei mitocondri congelati-scongelati, in cui viene misurata la riduzione del citocromo c (cyt c). Il test si basa sull’effetto di Na+ sull’IMM, diminuendone la fluidità. Qui presentiamo un protocollo per misurare l’attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi e le attività della succinato-cyt c ossidoreduttasi in presenza di NaCl o KCl. Le reazioni, che si basano sulla miscela di reagenti in una cuvetta in modo graduale, vengono misurate spettrofotometricamente durante 4 minuti in presenza di Na+ o K+. La stessa miscela viene eseguita in parallelo in presenza degli specifici inibitori enzimatici al fine di sottrarre la variazione aspecifica dell’assorbanza. L’attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi non diminuisce in presenza di nessuno di questi cationi. Tuttavia, l’attività della succinato-cit c ossidoreduttasi diminuisce in presenza di NaCl. Questo semplice esperimento evidenzia: 1) l’effetto di Na+ nel diminuire la fluidità IMM e il trasferimento di CoQ; 2) che il supercomplesso I+III2 protegge il trasferimento di ubichinone (CoQ) dall’essere influenzato dall’abbassamento della fluidità IMM; 3) che il trasferimento di CoQ tra CI e CIII è funzionalmente diverso dal trasferimento di CoQ tra CII e CIII. Questi fatti supportano l’esistenza di pool di CoQ funzionalmente differenziati nell’IMM e mostrano che possono essere regolati dal mutevole ambiente Na+ dei mitocondri.
Introduction
Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell’adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH2). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH2. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH2 in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV (CIV) ossida cyt c e riduce l’ossigeno in acqua. Questa catena di ossidoriduzione, la cosiddetta catena di trasporto degli elettroni (mETC), è accoppiata al pompaggio di H + attraverso l’IMM, che crea un gradiente elettrochimico utilizzato dal complesso V (CV) per fosforilare l’adenosina difosfato (ADP) in ATP.
I complessi mETC possono essere soli nell’IMM o assemblarsi in strutture quaternarie chiamate supercomplessi. CIV può assemblarsi con CIII, formando il III2+IV o Q-respirasome (in quanto è in grado di respirare in presenza di CoQH2)1,2,3 o formando omodimeri o omooligomeri4. CIII può interagire con CI, formando il supercomplesso I+III25. Infine, CI è anche in grado di interagire con il Q-respirasome, costruendo l’I+III2+IV o N-respirasome (in quanto può respirare consumando NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c sono portatori mobili di elettroni incaricati di trasferire elettroni da CI/CII a CIII e da CIII a CIV, rispettivamente. Se i supercomplessi impongano o meno una restrizione locale funzionale per questi vettori è stato oggetto di intenso dibattito negli ultimi due decenni 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che CoQ e cyt c possono essere segmentati funzionalmente in pool nell’IMM. Per quanto riguarda il CoQ, può essere segmentato funzionalmente in uno specifico pool di CoQ per CI (CoQNAD) e un altro pool dedicato agli enzimi FAD-dipendenti (CoQFAD)1,7,12,18,19. Tuttavia, al fine di differenziare l’esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, è stata richiesta la sovraespressione dell’ossidasi alternativa (AOX) e la generazione di specifici mutanti del mtDNA, che possono assemblare CI in assenza di CIII, 1,19,20.
Il meccanismo di produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) durante l’ipossia era sconosciuto fino a poco tempo fa. In caso di ipossia acuta, l’IC subisce la transizione attiva/disattivativa (A/D), che comporta la diminuzione della sua attività di pompaggio H+ della NADH-CoQ ossidoreduttasi. Tale diminuzione del pompaggio H+ acidifica la matrice mitocondriale e dissolve parzialmente i precipitati calcio-fosfato nella matrice mitocondriale, rilasciando Ca2+ solubile. Questo aumento di Ca2+ solubile attiva lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCLX), che estrude Ca2+ in cambio di Na+. L’aumento mitocondriale di Na+ interagisce con i fosfolipidi nel lato interno dell’IMM, diminuendone la fluidità e il trasferimento di CoQ tra CII e CIII, producendo infine anione superossido, un segnale redox21. È interessante notare che il trasferimento di CoQ è diminuito solo tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII, evidenziando che 1) Na + è stato in grado di modulare solo uno dei pool coQ esistenti nei mitocondri; 2) esistono pool di CoQ funzionalmente differenziati nell’IMM. Pertanto, un protocollo ampiamente utilizzato per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali può essere utilizzato per valutare l’esistenza dei pool di CoQ menzionati.
L’attuale protocollo si basa sulla misura della riduzione del cyt c ossidato, il substrato del CIII, per assorbanza in presenza di succinato (cioè substrato CII) o NADH (cioè substrato CI). Lo stesso campione è diviso in due, uno dei quali sarà trattato con KCl e l’altro con la stessa concentrazione di NaCl. In questo modo, dato che Na+ diminuisce la fluidità IMM, se coQ esistesse in un pool unico nell’IMM, sia CI+CIII che CII+CIII diminuirebbero in presenza di Na+. Tuttavia, se il CoQ esistesse in pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, l’effetto di Na+ sarebbe per lo più (o solo) evidente sull’attività CII+CIII, ma non sull’IC+CIII. Come recentemente pubblicato21, Na+ influisce solo sul trasferimento di CoQ tra CII e CIII (Figura 1C,D), ma non tra CI e CIII (Figura 1A,B).
Questo protocollo, insieme a una panoplia di tecniche, è stato utilizzato per confermare l’esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati nell’IMM, uno dedicato all’IC (cioè CoQNAD) e un altro dedicato agli enzimi legati alla FAD (cioè CoQFAD)1,3,7; un’osservazione che, sebbene continui ad essere discussa22, è stata corroborata indipendentemente da diversi gruppi 7,19. Pertanto, il superassemblaggio di CI in supercomplessi influisce sulla mobilità locale del CoQ, facilitandone l’utilizzo da parte del CIII all’interno del supercomplesso 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene questo protocollo rappresenti una procedura molto semplice per identificare l’esistenza dei pool di CoQ parzialmente segmentati, ci sono alcuni passaggi critici da prendere in considerazione. I substrati (cioè NADH o succinato) sono preferibilmente aggiunti per ultimi poiché può verificarsi l’autoossidazione di questi composti. Il capovolgimento della cuvetta deve essere attento per evitare la formazione di bolle che potrebbero interferire con la lettura.
Inoltre, la presente tecnic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., dr C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez per l’assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). Il CNIC è sostenuto dall’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia, dall’Innovación y Universidades (MCNU) e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figura 2 creata con BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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