Denne protokollen beskriver en komparativ analyse, ved hjelp av mitokondrie komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær av Na +, for å studere eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger.
Ubiquinone (CoQ) bassenger i den indre mitokondriemembranen (IMM) er delvis segmentert til enten komplekse I- eller FAD-avhengige enzymer. Slike underavdelinger kan enkelt vurderes ved en komparativ analyse ved hjelp av NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne mitokondrier, der cytokrom c (cyt c) reduksjon måles. Analysen er avhengig av effekten av Na+ på IMM, og reduserer flyten. Her presenterer vi en protokoll for å måle NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet og succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteter i nærvær av NaCl eller KCl. Reaksjonene, som er avhengige av blandingen av reagenser i en cuvette på en trinnvis måte, måles spektrofotometrisk i løpet av 4 minutter i nærvær av Na + eller K +. Den samme blandingen utføres parallelt i nærvær av de spesifikke enzymhemmerne for å trekke fra den uspesifiserte endringen i absorbans. NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet reduseres ikke i nærvær av noen av disse kasjonene. Imidlertid reduseres succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteten i nærvær av NaCl. Dette enkle eksperimentet fremhever: 1) effekten av Na + i avtagende IMM-fluiditet og CoQ-overføring; 2) at supercomplex I +III2 beskytter ubiquinone (CoQ) overføring fra å bli påvirket av å senke IMM-fluiditet; 3) at CoQ overføring mellom CI og CIII er funksjonelt forskjellig fra CoQ overføring mellom CII og CIII. Disse fakta støtter eksistensen av funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM og viser at de kan reguleres av det skiftende Na + -miljøet i mitokondrier.
Mitokondrie oksidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er hovedveien som driver adenosintrifosfat (ATP) syntese, reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, og forbruk av redusere ekvivalenter, som nikotinamid adenin dinucleotide (NADH) eller succinat, av mitokondrier. OXPHOS-systemet består av fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oksiderer NADH og reduserer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oksiderer succinat til fumarat og reduserer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oksiderer CoQH2 tilbake til CoQ, noe som reduserer cytokrom c (cyt c). Til slutt oksiderer komplekse IV (CIV) cyt c og reduserer oksygen til vann. Denne oksidoreduksjonskjeden, den såkalte elektrontransportkjeden (mETC), er koblet til pumping av H+ over IMM, noe som skaper en elektrokjemisk gradient som brukes av kompleks V (CV) til fosforylat adenosindifosfat (ADP) til ATP.
mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvartære strukturer kalt superkompatibiliteter. CIV kan samles med CIII, danner III2 +IV eller Q-respirasome (som det er i stand til å respirere i nærvær av CoQH2)1,2,3 eller danner homodimers eller homooligomerer4. CIII kan samhandle med CI, og danner supercomplex I +III25. Til slutt er CI også i stand til å samhandle med Q-respirasome, bygge I + III2 + IV eller N-respirasome (som det kan respirere forbruker NADH) 1,6,7,8,9,10.
CoQ og cyt c er mobile elektronbærere som har ansvaret for å overføre elektroner fra CI / CII til CIII, og fra CIII til CIV, henholdsvis. Hvorvidt supercomplexes pålegger en funksjonell lokal begrensning for disse transportørene har vært et spørsmål om intens debatt gjennom de siste to tiårene 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uavhengige grupper har imidlertid vist at CoQ og cyt c kan segmenteres funksjonelt i bassenger i IMM. Når det gjelder CoQ, kan den segmenteres funksjonelt i et spesifikt CoQ-basseng for CI (CoQNAD) og et annet basseng dedikert til FAD-avhengige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For å skille mellom eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, var imidlertid overekspressionen av den alternative oksidasen (AOX) og generasjonen av spesifikke mtDNA-mutanter, som kan montere CI i fravær av CIII, nødvendig 1,19,20.
Mekanismen for reaktiv oksygenart (ROS) produksjon under hypoksi var ukjent inntil nylig. Ved akutt hypoksi gjennomgår CI den aktive/deaktiveringsovergangen (A/D), som innebærer reduksjonen i H+ pumping av NADH-CoQ oksidoreductaseaktivitet. En slik reduksjon i H + pumping syrer mitokondriematrisen og oppløser delvis kalsiumfosfatutfellingene i mitokondriematrisen, og frigjør løselig Ca2 +. Denne økningen i løselig Ca2+ aktiverer Na +/Ca2+ veksler (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte mot Na+. Mitokondrie Na + økning samhandler med fosfolipider på innsiden av IMM, reduserer fluiditeten og CoQ-overføringen mellom CII og CIII, og produserer til slutt superoksidanion, et redokssignal21. Interessant nok ble CoQ-overføringen bare redusert mellom CII og CIII, men ikke mellom CI og CIII, og fremhevet at 1) Na + bare var i stand til å modulere ett av de eksisterende CoQ-bassengene i mitokondriene; 2) det finnes funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM. Dermed kan en mye brukt protokoll for studiet av mitokondrie enzymaktiviteter brukes til å vurdere eksistensen av de nevnte CoQ-bassengene.
Den nåværende protokollen er basert på måling av reduksjon av oksidert cyt c, substratet til CIII, ved absorbans i nærvær av succinat (dvs. CII substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøven er delt inn i to, hvorav den ene vil bli behandlet med KCl, og den andre med samme konsentrasjon av NaCl. På denne måten, gitt at Na + reduserer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterte i et unikt basseng i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII reduseres i nærvær av Na +. Imidlertid, hvis CoQ eksisterte i delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, ville effekten av Na + for det meste (eller bare) være tydelig på CII + CIII-aktiviteten, men ikke på CI + CIII. Som nylig publisert21, påvirker Na + bare CoQ-overføringen mellom CII og CIII (figur 1C, D), men ikke mellom CI og CIII (figur 1A, B).
Denne protokollen, sammen med en panoply av teknikker, har blitt brukt til å bekrefte eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger i IMM, en dedikert til CI (dvs. CoQNAD), og en annen dedikert til FAD-tilknyttede enzymer (dvs. CoQFAD) 1,3,7; en observasjon om at selv om det fortsatt er debattert22, har blitt bekreftet uavhengig av flere grupper 7,19. Dermed påvirker supermonteringen av CI i superkompatibiliteter den lokale mobiliteten til CoQ, noe som letter bruken av CIII innenfor supercomplex 1,7,13,14,23,24,25.
Selv om denne protokollen representerer en veldig grei prosedyre for å identifisere eksistensen av de delvis segmenterte CoQ-bassengene, er det noen få kritiske trinn å ta hensyn til. Substrater (dvs. NADH eller succinate) tilsettes fortrinnsvis sist siden autooksidasjon av disse forbindelsene kan forekomme. Cuvettes flipping må være forsiktig for å unngå dannelse av bobler som kan forstyrre avlesningen.
I tillegg presenterer den nåværende teknikken noen begrensninger som er verdt å …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 opprettet med BioRender.com.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |