आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली Na + के लिए संवेदनशीलता आंशिक रूप से विभाजित कार्यात्मक CoQ पूल से पता चलता है
Summary
यह प्रोटोकॉल एक तुलनात्मक परख का वर्णन करता है, माइटोकॉन्ड्रियल जटिल गतिविधियों CI + CIII और CII + CIII का उपयोग Na + की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, आंशिक रूप से खंडित कार्यात्मक CoQ पूल के अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए।
Abstract
आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) में यूबीक्विनोन (सीओक्यू) पूल आंशिक रूप से या तो जटिल I या FAD-निर्भर एंजाइमों के लिए विभाजित होते हैं। इस तरह के उपखंड को आसानी से एक तुलनात्मक परख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है NADH या जमे हुए पिघले हुए माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉन दाताओं के रूप में succinate का उपयोग करके, जिसमें साइटोक्रोम सी (साइट सी) कमी को मापा जाता है। परख आईएमएम पर Na + के प्रभाव पर निर्भर करता है, इसकी तरलता को कम करता है। यहां, हम NaCl या KCl की उपस्थिति में NADH-cyt c oxidoreductase गतिविधि और succinate-cyt c oxidoreductase गतिविधियों को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रतिक्रियाएं, जो एक चरणबद्ध तरीके से एक क्यूवेट में अभिकर्मकों के मिश्रण पर निर्भर करती हैं, को ना + या के + की उपस्थिति में 4 मिनट के दौरान स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जाता है। अवशोषण में अनिर्दिष्ट परिवर्तन को घटाने के लिए विशिष्ट एंजाइम अवरोधकों की उपस्थिति में समानांतर में एक ही मिश्रण किया जाता है। NADH-cyt c oxidoreductase गतिविधि इन धनायनों में से किसी की उपस्थिति में कमी नहीं करती है। हालांकि, Succinate-cyt c oxidoreductase गतिविधि NaCl की उपस्थिति में कम हो जाती है। यह सरल प्रयोग हाइलाइट करता है: 1) आईएमएम तरलता और कोक्यू हस्तांतरण को कम करने में ना + का प्रभाव; 2) कि सुपरकॉम्प्लेक्स I + III2 आईएमएम तरलता को कम करने से प्रभावित होने से यूबीक्विनोन (सीओक्यू) हस्तांतरण की रक्षा करता है; 3) कि CI और CIII के बीच CoQ स्थानांतरण कार्यात्मक रूप से CII और CIII के बीच CoQ हस्तांतरण से अलग है। ये तथ्य आईएमएम में कार्यात्मक रूप से विभेदित CoQ पूल के अस्तित्व का समर्थन करते हैं और दिखाते हैं कि उन्हें माइटोकॉन्ड्रिया के बदलते Na + वातावरण द्वारा विनियमित किया जा सकता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन सिस्टम (OXPHOS) एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) संश्लेषण, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, और माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा निकोटीनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) या सक्सिनेट जैसे समकक्षों को कम करने का मुख्य मार्ग है। OXPHOS प्रणाली पांच प्रोटीन परिसरों से बना है: कॉम्प्लेक्स I (CI) NADH को ऑक्सीकरण करता है और CoQ को यूबीक्विनॉल (CoQH2) में कम कर देता है। कॉम्प्लेक्स II (CII) fumarate में succinate oxidizes और CoQH2 में CoQ को कम कर देता है। जटिल III (CIII) CoQH2 को वापस CoQ में ऑक्सीकरण करता है, जिससे साइटोक्रोम c (cyt c) कम हो जाता है। अंत में, जटिल IV (CIV) साइट c को ऑक्सीकरण करता है और पानी में ऑक्सीजन को कम करता है। यह ऑक्सीडोरडक्शन चेन, तथाकथित इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (एमईटीसी), आईएमएम में एच + के पंपिंग के लिए युग्मित है, जो एटीपी में एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) को फॉस्फोराइलेट करने के लिए जटिल वी (सीवी) द्वारा उपयोग किए जाने वाले एक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट का निर्माण करता है।
mETC कॉम्प्लेक्स या तो आईएमएम में अकेले हो सकते हैं या सुपरकॉम्प्लेक्स नामक चतुर्भुज संरचनाओं में इकट्ठा हो सकते हैं। CIV CIII के साथ इकट्ठा हो सकता है, III2 + IV या Q-respirasome का निर्माण कर सकता है (क्योंकि यह CoQH 2) 1,2,3 की उपस्थिति में सांस लेने में सक्षम है या होमोडिमर्स या होमोलिगोमर्स4 बना सकता है। CIII सीआई के साथ बातचीत कर सकता है, जिससे सुपरकॉम्प्लेक्स I + III25 बन सकता है। अंत में, सीआई क्यू-रेस्पिरोसोम के साथ बातचीत करने में भी सक्षम है, जो I + III2 + IV या एन-रेस्पिरोसोम का निर्माण करता है (क्योंकि यह NADH का उपभोग करने वाले श्वसन कर सकता है) 1,6,7,8,9,10।
CoQ और cyt c मोबाइल इलेक्ट्रॉन वाहक हैं जो क्रमशः CI/ CII से CIII तक और CIII से CIV तक इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करने के प्रभारी हैं। सुपरकॉम्प्लेक्स इन वाहकों के लिए एक कार्यात्मक स्थानीय प्रतिबंध लगाते हैं या नहीं, पिछले दो दशकों के दौरान गहन बहस का विषय रहा है 2,7,11,12,13,14,15,16,17। हालांकि, कई स्वतंत्र समूहों ने प्रदर्शित किया है कि कोक्यू और साइट सी को आईएमएम में पूल में कार्यात्मक रूप से विभाजित किया जा सकता है। CoQ के संबंध में, इसे कार्यात्मक रूप से CI (CoQNAD) के लिए एक विशिष्ट CoQ पूल में विभाजित किया जा सकता है और FAD-निर्भर एंजाइमों (CoQFAD) 1,7,12,18,19 को समर्पित एक और पूल। हालांकि, आंशिक रूप से खंडित कार्यात्मक कोक्यू पूल के अस्तित्व को अलग करने के लिए, वैकल्पिक ऑक्सीडेज (एओएक्स) के ओवरएक्सप्रेशन और विशिष्ट एमटीडीएनए म्यूटेंट की पीढ़ी, जो सीआईआईआई की अनुपस्थिति में सीआई को इकट्ठा कर सकती है, को 1,19,20 की आवश्यकता थी।
हाइपोक्सिया के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन का तंत्र हाल ही में अज्ञात था। तीव्र हाइपोक्सिया पर, सीआई सक्रिय / निष्क्रिय (ए / डी) संक्रमण से गुजरता है, जिसमें इसके एच + पंपिंग एनएडीएच-कोक्यू ऑक्सीडोरेडक्टेस गतिविधि में कमी शामिल है। एच + पंपिंग में इस तरह की कमी माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को अम्लीकृत करती है और आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में कैल्शियम-फॉस्फेट अवक्षेप को भंग कर देती है, घुलनशील सीए2 + जारी करती है। घुलनशील Ca2+ में यह वृद्धि Na+/Ca2+ एक्सचेंजर (NCLX) को सक्रिय करती है, जो Na+ के बदले Ca2+ को बाहर निकालती है। माइटोकॉन्ड्रियल ना + वृद्धि आईएमएम के आंतरिक पक्ष में फॉस्फोलिपिड्स के साथ बातचीत करती है, सीआईआई और सीआईआईआई के बीच इसकी तरलता और सीओक्यू हस्तांतरण को कम करती है, अंत में सुपरऑक्साइड अनियन, एक रेडॉक्स सिग्नल21 का उत्पादन करती है। दिलचस्प बात यह है कि CoQ हस्तांतरण केवल CII और CIII के बीच कम हो गया था, लेकिन CI और CIII के बीच नहीं, यह उजागर करते हुए कि 1) Na + माइटोकॉन्ड्रिया में मौजूदा CoQ पूल में से केवल एक को संशोधित करने में सक्षम था; 2) आईएमएम में कार्यात्मक रूप से विभेदित CoQ पूल मौजूद हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम गतिविधियों के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का उपयोग उल्लिखित कोक्यू पूल के अस्तित्व का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल ऑक्सीकृत साइट सी, CIII के सब्सट्रेट की कमी के माप पर आधारित है, succinate (यानी, CII सब्सट्रेट) या NADH (यानी, CI सब्सट्रेट) की उपस्थिति में absorbance द्वारा। एक ही नमूने को दो में विभाजित किया गया है, जिनमें से एक को KCl के साथ इलाज किया जाएगा, और दूसरा NaCl की समान एकाग्रता के साथ। इस तरह, यह देखते हुए कि Na + IMM तरलता को कम करता है, यदि CoQ IMM में एक अद्वितीय पूल में मौजूद है, तो CI + CIII और CII + CIII दोनों Na + की उपस्थिति में कमी आएगी। हालांकि, यदि CoQ आंशिक रूप से विभाजित कार्यात्मक CoQ पूल में मौजूद था, तो Na + का प्रभाव ज्यादातर (या केवल) CII + CIII गतिविधि पर स्पष्ट होगा, लेकिन CI + CIII पर नहीं। जैसा कि हाल ही में प्रकाशित21, Na + केवल CII और CIII (चित्रा 1C, D) के बीच CoQ हस्तांतरण को प्रभावित करता है, लेकिन CIII और CIII (चित्रा 1A, B) के बीच नहीं।
इस प्रोटोकॉल, तकनीकों के एक पैनोपली के साथ, आईएमएम में आंशिक रूप से विभाजित कार्यात्मक CoQ पूल के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया गया है, एक CI (यानी, CoQNAD) को समर्पित है, और एक और FAD-लिंक्ड एंजाइमों (यानी, CoQFAD) के लिए समर्पित है 1,3,7; एक अवलोकन है कि, हालांकि यह22 बहस जारी है, कई समूहों 7,19 द्वारा स्वतंत्र रूप से पुष्टि की गई है। इस प्रकार, सुपरकॉम्प्लेक्स में सीआई का सुपरअसेंबली सीओक्यू की स्थानीय गतिशीलता पर प्रभाव डालता है, जो सुपरकॉम्प्लेक्स 1,7,13,14,23,24,25 के भीतर सीआईआईआई द्वारा इसके उपयोग की सुविधा प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि यह प्रोटोकॉल आंशिक रूप से खंडित कोक्यू पूल के अस्तित्व की पहचान करने के लिए एक बहुत ही सरल प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन ध्यान में रखने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। Substrates (यानी, NADH या su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए डॉ आर मार्टिनेज-डी-मेना, एम एम मुनोज़-हर्नांडेज़, ए, डॉ सी जिमेनेज़ और ई आर मार्टिनेज़-जिमेनेज़ को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को MICIN द्वारा समर्थित किया गया था: RTI2018-099357-B-I00 और HFSP (RGP0016/2018)। CNIC Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) और प्रो CNIC फाउंडेशन द्वारा समर्थित है और एक Severo Ochoa उत्कृष्टता केंद्र (SEV-2015-0505) है। चित्र2 BioRender.com के साथ बनाया गया है।
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
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