Inre mitokondriell membrankänslighet för Na + avslöjar delvis segmenterade funktionella Q-pooler
Summary
Detta protokoll beskriver en jämförande analys, med hjälp av mitokondriella komplexa aktiviteter CI + CIII och CII + CIII i närvaro eller frånvaro av Na +, för att studera förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler.
Abstract
Ubikinon (Q) pooler i det inre mitokondriella membranet (IMM) är delvis segmenterade till antingen komplexa I- eller FAD-beroende enzymer. Sådan indelning kan enkelt bedömas genom en jämförande analys med NADH eller succinat som elektrondonatorer i fruset tinade mitokondrier, där cytokrom c (cyt c) reduktion mäts. Analysen är beroende av effekten av Na+ på IMM, vilket minskar dess flytbarhet. Här presenterar vi ett protokoll för att mäta NADH-cyt c oxidoreduktasaktivitet och succinat-cyt c-oxidoreduktasaktiviteter i närvaro av NaCl eller KCl. Reaktionerna, som är beroende av blandningen av reagens i en kyvett stegvis, mäts spektrofotometriskt under 4 minuter i närvaro av Na+ eller K+. Samma blandning utförs parallellt i närvaro av de specifika enzymhämmare för att subtrahera den ospecifika förändringen i absorbans. NADH-cyt c oxidoreduktasaktivitet minskar inte i närvaro av någon av dessa katjoner. Succinat-cyt c-oxidoreduktasaktiviteten minskar emellertid i närvaro av NaCl. Detta enkla experiment belyser: 1) effekten av Na + för att minska IMM-fluiditet och Q-överföring; 2) att superkomplex I +III2 skyddar ubikinonöverföring (Q) från att påverkas av att sänka IMM-fluiditeten; 3) att Q-överföring mellan CI och CIII skiljer sig funktionellt från Q-överföring mellan CII och CIII. Dessa fakta stöder förekomsten av funktionellt differentierade Q-pooler i IMM och visar att de kan regleras av mitokondriernas föränderliga Na + – miljö.
Introduction
Mitokondriellt oxidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) är den huvudsakliga vägen som driver adenosintrifosfat (ATP) syntes, reaktiva syrearter (ROS) produktion och konsumtion av reducerande ekvivalenter, såsom nikotinamidadenindinukleotid (NADH) eller succinat, av mitokondrier. OXPHOS-systemet består av fem proteinkomplex: Komplex I (CI) oxiderar NADH och reducerar Q till ubiquinol (QH2). Komplex II (CII) oxiderar succinat till fumarat och reducerar Q till QH2. Komplex III (CIII) oxiderar QH2 tillbaka till Q, vilket minskar cytokrom c (cyt c). Slutligen oxiderar komplex IV (CIV) cyt c och reducerar syre till vatten. Denna oxidoreduktionskedja, den så kallade elektrontransportkedjan (mETC), är kopplad till pumpning av H + över IMM, vilket skapar en elektrokemisk gradient som används av komplex V (CV) för att fosforylera adenosindifosfat (ADP) till ATP.
mETC-komplex kan antingen vara ensamma i IMM eller monteras i kvartära strukturer som kallas superkomplex. CIV kan monteras med CIII och bilda III2 + IV eller Q-respirasom (eftersom den kan andas i närvaro av CoQH2) 1,2,3 eller bilda homodimerer eller homooligomerer4. CIII kan interagera med CI och bilda superkomplexet I+III25. Slutligen kan CI också interagera med Q-respirasomen och bygga I + III2 + IV eller N-respirasom (eftersom den kan respirera konsumerar NADH)1,6,7,8,9,10.
Q och cyt c är mobila elektronbärare som ansvarar för att överföra elektroner från CI / CII till CIII respektive från CIII till CIV. Huruvida superkomplex inför en funktionell lokal begränsning för dessa transportörer har varit en fråga om intensiv debatt under de senaste två decennierna 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flera oberoende grupper har dock visat att Q och cyt c funktionellt kan segmenteras i pooler i IMM. När det gäller Q kan den funktionellt segmenteras i en specifik Q-pool för CI (CoQNAD) och en annan pool dedikerad till FAD-beroende enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. För att differentiera förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler krävdes emellertid överuttrycket av det alternativa oxidaset (AOX) och genereringen av specifika mtDNA-mutanter, som kan montera CI i frånvaro av CIII, 1,19,20.
Mekanismen för produktion av reaktiva syrearter (ROS) under hypoxi var okänd tills nyligen. Vid akut hypoxi genomgår CI den aktiva / deaktiva (A / D) övergången, vilket innebär minskningen av dess H + pumpande NADH-CoQ-oxidoreduktasaktivitet. En sådan minskning av H + -pumpningen försurar mitokondriell matris och löser delvis upp kalciumfosfatutfällningarna i mitokondriell matris och frigör löslig Ca2+. Denna ökning av löslig Ca2+ aktiverar Na+/Ca2+ -växlaren (NCLX), som extruderar Ca2+ i utbyte mot Na+. Mitokondriell Na + -ökning interagerar med fosfolipider på insidan av IMM, vilket minskar dess fluiditet och Q-överföring mellan CII och CIII, vilket slutligen producerar superoxidanjon, en redoxsignal21. Intressant nog minskade Q-överföringen endast mellan CII och CIII, men inte mellan CI och CIII, vilket belyser att 1) Na + endast kunde modulera en av de befintliga Q-poolerna i mitokondrierna; 2) det finns funktionellt differentierade Q-pooler i IMM. Således kan ett allmänt använt protokoll för studier av mitokondriella enzymaktiviteter användas för att bedöma förekomsten av de nämnda Q-poolerna.
Det aktuella protokollet är baserat på mätningen av reduktionen av oxiderad cyt c, substratet av CIII, genom absorbans i närvaro av succinat (dvs CII-substrat) eller NADH (dvs CI-substrat). Samma prov är uppdelat i två, varav en kommer att behandlas med KCl och den andra med samma koncentration av NaCl. På detta sätt, med tanke på att Na + minskar IMM-fluiditeten, om Q fanns i en unik pool i IMM, skulle både CI + CIII och CII + CIII minska i närvaro av Na +. Men om Q fanns i delvis segmenterade funktionella Q-pooler skulle effekten av Na+ mestadels (eller endast) vara uppenbar på CII+CIII-aktiviteten, men inte på CI+CIII. Som nyligenpublicerats 21 påverkar Na+ endast Q-överföringen mellan CII och CIII (figur 1C,D), men inte mellan CI och CIII (figur 1A,B).
Detta protokoll, tillsammans med en mängd tekniker, har använts för att bekräfta förekomsten av delvis segmenterade funktionella Q-pooler i IMM, en dedikerad till CI (dvs. QNAD) och en annan tillägnad FAD-länkade enzymer (dvs. Q FAD)1,3,7; en iakttagelse som, även om den fortsätter att debatteras22, har bekräftats oberoende av flera grupper 7,19. Således påverkar supermonteringen av CI till superkomplex den lokala rörligheten för Q, vilket underlättar dess användning av CIII inom superkomplexet 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om detta protokoll representerar ett mycket enkelt förfarande för att identifiera förekomsten av de delvis segmenterade Q-poolerna, finns det några kritiska steg att ta hänsyn till. Substrat (dvs NADH eller succinat) tillsätts företrädesvis sist eftersom autooxidering av dessa föreningar kan förekomma. Kyvettes vändning måste vara försiktig för att undvika bildandet av bubblor som kan störa avläsningen.
Dessutom presenterar den nuvarande tekniken några begränsningar som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez och E. R. Martínez-Jimenez för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av MICIN: RTI2018-099357-B-I00 och HFSP (RGP0016/2018). CNIC stöds av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) och Pro CNIC Foundation och är ett Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Bild 2 skapad med BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
References
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
