JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Indre mitokondriemembranfølsomhed over for Na+ afslører delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/63729
,
1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, 2Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

Summary

Denne protokol beskriver et komparativt assay ved hjælp af mitokondrielle komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær af Na + for at studere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer.

Abstract

Ubiquinon (CoQ) puljer i den indre mitokondriemembran (IMM) er delvist segmenteret til enten komplekse I eller FAD-afhængige enzymer. En sådan opdeling kan let vurderes ved et komparativt assay ved anvendelse af NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne optøede mitokondrier, hvor cytokrom c (cyt c) reduktion måles. Assayet er afhængig af effekten af Na + på IMM, hvilket reducerer dets fluiditet. Her præsenterer vi en protokol til måling af NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet og succinat-cyt c oxidoreduktaseaktiviteter i nærvær af NaCl eller KCl. Reaktionerne, der er afhængige af blandingen af reagenser i en kuvette trinvist, måles spektrofotometrisk i løbet af 4 minutter i nærværelse af Na+ eller K+. Den samme blanding udføres parallelt i nærvær af de specifikke enzymhæmmere for at trække den uspecifikke ændring i absorbans fra. NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet falder ikke i nærvær af nogen af disse kationer. Imidlertid falder succinat-cyt c oxidoreductaseaktiviteten i nærvær af NaCl. Dette enkle eksperiment fremhæver: 1) effekten af Na + i faldende IMM-fluiditet og CoQ-overførsel; 2) at superkompleks I+III2 beskytter ubiquinon (CoQ) overførsel mod at blive påvirket af sænkning af IMM fluiditeten; 3) at CoQ-overførslen mellem CI og CIII er funktionelt forskellig fra CoQ-overførslen mellem CII og CIII. Disse fakta understøtter eksistensen af funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM og viser, at de kan reguleres af mitokondriernes skiftende Na+- miljø.

Introduction

Mitokondrielt oxidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er den vigtigste vej, der driver adenosintrifosfatsyntese (ATP), reaktiv iltartsproduktion (ROS) og forbrug af reducerende ækvivalenter, såsom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) eller succinat, af mitokondrier. OXPHOS-systemet består af fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oxiderer NADH og reducerer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oxiderer succinat tilfumarat og reducerer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oxiderer CoQH2 tilbage til CoQ, hvilket reducerer cytokrom c (cyt c). Endelig oxiderer kompleks IV (CIV) cyt c og reducerer ilt til vand. Denne oxidoreduktionskæde, den såkaldte elektrontransportkæde (mETC), er koblet til pumpning af H + over IMM, hvilket skaber en elektrokemisk gradient, der anvendes af kompleks V (CV) til fosforylat adenosindiphosphat (ADP) i ATP.

mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvaternære strukturer kaldet superkomplekser. CIV kan samles med CIII og danne III2+IV eller Q-respirasomet (da det er i stand til at respirere i nærvær af CoQH2)1,2,3 eller danne homodimerer eller homooligomerer4. CIII kan interagere med CI og danne superkomplekset I+ III25. Endelig er CI også i stand til at interagere med Q-respirasomet og opbygge I + III2 + IV eller N-respirasomet (da det kan respirere forbrugende NADH) 1,6,7,8,9,10.

CoQ og cyt c er mobile elektronbærere, der har ansvaret for at overføre elektroner fra henholdsvis CI / CII til CIII og fra CIII til CIV. Hvorvidt superkomplekser pålægger en funktionel lokal begrænsning for disse luftfartsselskaber har været et spørgsmål om intens debat gennem de sidste to årtier 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uafhængige grupper har imidlertid vist, at CoQ og cyt c funktionelt kan segmenteres i puljer i IMM. Med hensyn til CoQ kan den funktionelt segmenteres i en specifik CoQ-pulje for CI (CoQNAD) og en anden pulje dedikeret til FAD-afhængige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For at differentiere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer var overekspression af den alternative oxidase (AOX) og generering af specifikke mtDNA-mutanter, som kan samle CI i fravær af CIII, imidlertid påkrævet 1,19,20.

Mekanismen for reaktiv iltart (ROS) produktion under hypoxi var ukendt indtil for nylig. Ved akut hypoxi gennemgår CI den aktive/deaktive (A/D) overgang, som indebærer et fald i dets H+ -pumpende NADH-CoQ oxidoreduktaseaktivitet. Et sådant fald i H + -pumpning syrner mitokondriematrixen og opløser delvist calciumphosphatudfælderne i mitokondriematrixen og frigiver opløselig Ca2+. Denne stigning i opløselig Ca2+ aktiverer Na+/Ca2+- veksleren (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte for Na+. Mitokondriel Na + -stigning interagerer med phospholipider i indersiden af IMM, hvilket reducerer dets fluiditet og CoQ-overførsel mellem CII og CIII, hvilket endelig producerer superoxidanion, et redoxsignal21. Interessant nok blev CoQ-overførslen kun formindsket mellem CII og CIII, men ikke mellem CI og CIII, hvilket fremhævede, at 1) Na + kun var i stand til at modulere en af de eksisterende CoQ-puljer i mitokondrierne; 2) der findes funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM. Således kan en meget anvendt protokol til undersøgelse af mitokondrielle enzymaktiviteter anvendes til at vurdere eksistensen af de nævnte CoQ-puljer.

Den nuværende protokol er baseret på måling af reduktionen af oxideret cyt c, substratet af CIII, ved absorbans i nærvær af succinat (dvs. CII-substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøve er opdelt i to, hvoraf den ene vil blive behandlet med KCl, og den anden med samme koncentration af NaCl. På denne måde, da Na + reducerer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterede i en unik pulje i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII falde i nærvær af Na +. Hvis CoQ eksisterede i delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer, ville effekten af Na+ imidlertid for det meste (eller kun) være tydelig på CII+CIII-aktiviteten, men ikke på CI+CIII. Som nyligt offentliggjort21 påvirker Na+ kun CoQ-overførslen mellem CII og CIII (figur 1C,D), men ikke mellem CI og CIII (figur 1A,B).

Denne protokol er sammen med et panoply af teknikker blevet brugt til at bekræfte eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer i IMM, en dedikeret til CI (dvs. CoQNAD) og en anden dedikeret til FAD-bundne enzymer (dvs. CoQFAD)1,3,7; en bemærkning, der, selv om den fortsat debatteres22, er blevet bekræftet uafhængigt af flere grupper 7,19. Således påvirker supermonteringen af CI i superkomplekser coq’s lokale mobilitet, hvilket letter brugen af CIII inden for superkomplekset 1,7,13,14,23,24,25.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen i pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af den institutionelle etiske komité ved Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanien, i overensstemmelse med EU-direktivet af 22. september 2010 (2010/63/UE) og med det spanske kongelige dekret af 1. februar 2013 (53/2013). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet af anvendte dyr og deres lidelse. BEMÆRK: Dette komparative as…

Representative Results

Typiske resultater fra denne protokol er repræsenteret nedenfor (figur 3). Da reduceret cyt c-absorbans lokaliserer sig ved 550 nm, skal alle uhæmmede delprøveudsempler vise en stigning i absorbansen ved 550 nm. Hæmmede delprøveudsempler viser ideelt set en flad linje eller lidt stigende hældning (figur 3). Skråninger fra hæmmede delprøveudtager skal trækkes fra uhæmmede delprøveudtager. Prøver A og B, begge korrigeret af…

Discussion

Selvom denne protokol repræsenterer en meget ligetil procedure til at identificere eksistensen af de delvist segmenterede CoQ-puljer, er der et par kritiske trin, der skal tages i betragtning. Substrater (dvs. NADH eller succinat) tilsættes fortrinsvis sidst, da autooxidering af disse forbindelser kan forekomme. Cuvettes flipping skal være forsigtig for at undgå dannelse af bobler, der kan forstyrre læsningen.

Derudover præsenterer den nuværende teknik et par begrænsninger, som er vær…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes af Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 oprettet med BioRender.com.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 10775835001
Bradford protein assay Bio-Rad 5000001
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KCl Sigma-Aldrich P3911
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NADH Roche 10107735001
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 207810
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Spectra Manager software JASCO version 2
Spectrophotometer UV/VISJASCO
Succinate Sigma-Aldrich 398055
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
  2. Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
  3. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  4. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  5. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
  6. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  7. Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
  8. Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
  9. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
  10. Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
  11. Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
  12. Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
  13. Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
  14. Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
  15. Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
  16. Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
  17. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  18. Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
  19. Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
  20. Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
  21. Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
  22. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
  23. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  24. Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
  25. Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
  26. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  27. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  28. den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
  29. Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
  30. Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
  31. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
  32. Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
  33. Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).

Tags

Na+ SensitivityMitochondrial MembraneCoQ PoolsElectron TransferLipid DropsCytochrome CMalonateRotenoneNADHAntimycin ASuccinate
check_url/63729?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hernansanz-Agustín, P., Enríquez, J. A. Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools. J. Vis. Exp. (185), e63729, doi:10.3791/63729 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image