Summary
基底膜对于发育过程中的组织和器官形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确放置的机制，所提出的方案描述了使用共聚焦和超分辨率显微镜可视化和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内运输和分泌的方法。
Abstract
基底膜（BM） - 存在于上皮细胞基底侧的细胞外基质的特化片 - 对于上皮组织形态和器官形态的建立和维持至关重要。此外，BM对于组织建模至关重要，可作为信号平台，并提供外力来塑造组织和器官。尽管BM在正常发育和病理条件下发挥了许多重要作用，但控制含BM囊泡细胞内运输的生物学途径以及基础分泌如何导致BM蛋白极化沉积的生物学途径知之甚少。 果蝇 卵巢的滤泡上皮是研究BM膜蛋白基础沉积的优秀模型系统，因为它产生并分泌BM的所有主要成分。本文介绍了一种详细的方案，用于在 果蝇 卵巢的滤泡上皮中使用内源性标记的蛋白质对含BM的囊泡和沉积的BM进行染色和成像。该协议可用于解决定性和定量问题，其开发是为了适应高通量筛选，从而可以快速有效地鉴定上皮组织发育过程中极化细胞内运输和囊泡分泌所涉及的因素。
Introduction
基底膜（BM）是一层层状细胞贴壁细胞外基质（ECM）的薄片，对上皮结构和形态发生1至关重要。它包含约50种蛋白质，并且无处不在地存在于上皮细胞和内皮细胞的下方，以及鞘状的骨骼，光滑，心肌细胞和脂肪细胞1，2，3。上皮细胞基底侧BM的三个主要成分是胶原IV，珀列坎和层粘连蛋白。BM位于上皮细胞之下，负责许多功能，包括组织分离和屏障，生长和支持，以及细胞极化2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12.它作为信号平台的作用调节发育过程中上皮细胞和组织的形态和分化3，13，14。此外，BM的错误调节和/或其完整性的破坏是许多病理状况的主要原因，包括肿瘤转移2，15，16。尽管BM在组织和器官形态发生期间具有基本功能，但专用于极化细胞内运输和BM蛋白分泌的生物途径的组分尚不清楚。
为了研究含BM囊泡的细胞内运输和上皮细胞分泌BM蛋白，果蝇卵巢的滤泡上皮（FE）是一个强大的模型系统（图1）。果蝇卵巢由16-20个长的管状结构组成，称为卵形（图1A，B）17，18，19。每个卵巢都可以被认为是一条卵子装配线，随着卵室（每个卵室产生卵子）的年龄进展，从前端开始向后移动，直到成熟的卵子通过输卵管排出。每个卵室都由FE（体细胞卵泡细胞（FC）的单层）封装，该FE围绕中央生殖细胞（GC）。FE高度极化，具有明显的顶基极性，其中顶端结构域面向种系，BM蛋白在基底层分泌18，19。FC积极分泌BM的所有主要成分，包括胶原IV，珀列康和层粘连蛋白20，21。在上皮细胞（如FC）中，产生BM组分并且需要专门的极化分泌途径才能在细胞外沉积。例如，在BM最丰富的成分胶原IV（Coll IV）的情况下，尽管其产生和沉积是许多研究的重点，但围绕其极化细胞内运输和分泌的细节是模糊的。Coll IV在内质网（ER）中翻译，这也是每个原纤维 - 由三个多肽（两个α1链和一个α2链）组成 - 组装成三螺旋22的地方。适当的 Coll IV 折叠和功能需要 ER 伴侣和酶，包括赖氨酰基和脯氨酰羟基酶，如 Plod 和 PH4αEFB20、22、23、24、25、26。这些翻译后酶调节Col IV的ER分选，因为每个酶的丢失导致Coll IV被困在基础ER20，23，24，25，26中。然后，新合成的Colli IV在COPII涂层囊泡中退出高尔基体的ER。货物受体Tango1有助于将胶原蛋白包装成可观的高尔基体结合囊泡，该囊泡可以容纳大型多聚体蛋白质20，27。一旦将Coliv包装成细胞内胞囊泡，它就会从上皮细胞特异性地分泌基底。为了将BM沉积引导到基底侧，上皮细胞需要另一组专门用于极化BM分泌的因子。使用果蝇卵巢的FE，已经表征了这种新型细胞过程的一些组分，包括核苷酸交换因子（GEFs）岩壁和地层，GTPases Rab8和Rab10，以及磷酸肌醇PI（4，5）P2和激肽1和3运动蛋白20，28，29，30，31的水平.这些成分对于确保BM蛋白的极化分布至关重要。
为了监测FE中BM蛋白的细胞内定位，可以使用内源性标记的基底膜蛋白（蛋白质陷阱），例如维京-GFP（Vkg-GFP或α2 Coll IV-GFP）和珍珠-GFP（Pcan-GFP）32，33。这些蛋白质陷阱谱系已被证明可以准确反映BM蛋白的内源性分布，并允许更灵敏地检测水泡运输28，30。首先使用Vkg-GFP和Pcan-GFP 20，28，29，30的蛋白质陷阱线表征了FE中BM极化沉积所涉及的组分。蛋白质陷阱可用于不同的遗传背景，包括突变体和Gal4系34。此外，蛋白质捕集器可以与荧光染料和/或荧光免疫染色结合使用，从而在比较野生型和突变条件35时精确表征BM蛋白的定位。
为了准确有效地评估含BM蛋白囊泡的分布和定位，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和超分辨率成像技术对其他成像方法具有显着优势。这些方法将高分辨率成像与相对易用性相结合。CLSM是一种显微镜技术，通过使用振镜以光栅扫描方式用激光扫描样品来提高光学分辨率。针孔孔径是共聚焦显微镜的核心部件。通过阻挡来自焦平面上方或下方的失焦信号，针孔孔径可在z轴36中产生非常优越的分辨率。这也使得在z平面中获得一系列图像成为可能，称为z-stack，对应于一系列光学截面。z-stack随后在成像软件的帮助下， 通过 3D重建创建标本的3D图像。与共聚焦显微镜不同，传统的落射荧光（宽视场）显微镜允许失焦光有助于提高图像质量，从而降低图像分辨率和对比度36，37。这使得落射荧光显微镜在研究蛋白质定位或共定位时不太有吸引力。
虽然CLSM是各种应用的合适方法，包括BM蛋白细胞内运输的成像和表征，但当对低于阿贝的光衍射极限（200-250nm）的样品进行成像时，它仍然存在问题。当对此类样品进行成像时，共聚焦显微镜，特别是在使用油物镜时，可以产生高分辨率。然而，超分辨率技术超越了共聚焦显微镜的极限。有多种方法可以实现超分辨率显微镜，每种方法都有特定的分辨率限制，并且每种方法都适用于不同的分析。这些方法包括光活化定位显微镜（PALM）或随机光学重建显微镜（STORM），受激发射耗尽显微镜（STED），结构化照明显微镜（SIM）和Airyscan（超分辨率）显微镜38，39，40，41，42，43，44，45，46.虽然艾瑞斯堪的分辨率比PALM/风暴、STED和SIM更粗糙，但它仍然可以达到高达~120纳米的分辨率（大约是CLSM分辨率的两倍）。此外，这种超分辨率显微镜方法已被证明在对厚样品和信噪比为47，48的低样品进行成像时比SIM和其他超分辨率技术具有优势。
艾利斯扫描是一种相对较新的超分辨率共聚焦显微镜技术46。与传统的CLSM不同，传统CLSM使用针孔和单点检测器来抑制失焦光，这种超分辨率方法使用32通道砷化镓磷化物（GaAsP）光电倍增管区域检测器，收集每个扫描位置45的所有光。32 个探测器中的每一个都作为一个小针孔工作，将针孔尺寸从传统的 1.0 Airy 单元 （A.U.） 减小到增强的 0.2 A.U.，从而实现更高的分辨率和信噪比，同时保持 1.25 A.U. 直径45 的效率。此外，Airyscan 使用的线性反卷积可使分辨率45 提高多达 2 倍。考虑到这一点，CLSM，特别是超分辨率显微镜，非常适合研究BM蛋白和调节BM蛋白基础沉积的蛋白质，因为它们可以产生非常高分辨率的图像用于定位和共定位研究，从而为控制这些过程的空间，时间和分子事件提供新的见解。
可用于执行定位实验的共聚焦显微镜的另一种方法是图像反卷积。由于宽视场显微镜允许失焦光到达探测器，因此可以应用数学和计算反卷积算法从宽视场显微镜获得的图像中去除或重新分配失焦光，从而提高图像49的分辨率和对比度。反卷积算法还可以应用于共聚焦图像，以进一步提高分辨率和对比度，从而产生几乎与超分辨率显微镜50相当的最终图像。Airyscan利用基于韦纳滤波器的反卷积以及谢泼德的像素重新分配，从而大大提高了空间分辨率和信噪比。与共聚焦显微镜相比，当使用这种超分辨率显微镜技术45，51时，在所有三个空间维度（x和y中为120nm，z中为350nm）的分辨率提高了2倍。
该手稿提供了详细和优化的方案，以染色，获取和可视化BM蛋白的细胞内运输和沉积，使用 果蝇 卵巢的FE作为模型系统，结合共聚焦和超分辨率显微镜。表达内源性标记基底膜蛋白（例如 Vkg-GFP 和 Pcan-GFP）的 果蝇 谱系是可视化 BM 蛋白运输和分泌的有效且准确的工具。此外，它们可以很容易地用于不同的遗传背景，包括突变体和 Gal4 / UAS 系34。虽然推荐使用内源性标记的基底膜蛋白，但针对特定BM蛋白的抗体的使用也与所述方案相容。这些方案对于有兴趣使用共聚焦和超分辨率成像研究细胞内运输和完整上皮组织中BM蛋白分泌的科学家特别有用。此外，将上皮组织分析与 果蝇 遗传学的扩展工具相结合的能力使这种方法特别强大。最后，这些方案可以很容易地适应研究水泡运输和其他感兴趣蛋白质的分选。
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Protocol
1. 卵巢解剖的苍蝇准备
- 将10-15只所需基因型的 黑腹果蝇雌性苍蝇（1-2天大）放入含有〜8mL 果蝇 培养基的狭窄小瓶中，撒上少量颗粒状面包酵母，然后在25°C解剖前2-3天。 在小瓶中添加一些雄性可以提高卵室产量。但是，请确保苍蝇总数不超过20只，因为这会对卵巢发育产生负面影响。
注：关于 果蝇 雄性和雌性的描述，以及对于没有 果蝇 经验的科学家的有用提示和建议，可以在引用的文章34，52中找到。添加酵母将刺激卵子的产生并产生代表不同阶段的卵巢。此外，它还会使卵巢变胖，使它们更容易切除。也可以使用湿酵母代替颗粒状酵母，但是，对于较弱的库存，苍蝇可能会被卡住并死亡。
2. 卵巢解剖和固定
注意：有关卵巢解剖和染色的其他资源，读者可参考引用的方案53，54，55。
- 在解剖当天，通过将PFA储备溶液稀释在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，制备终浓度为4%多聚甲醛（PFA）的新鲜固定溶液。
- 使用CO2 麻醉苍蝇并将其放在苍蝇垫上。保持苍蝇麻醉直至解剖。一旦苍蝇的运动停止，考虑正确麻醉苍蝇，这通常需要10-20秒。
注意：虽然建议使用CO2 作为更安全，更快捷的选择，但苍蝇可以用冰麻醉。 - 将带有浅凹陷孔的玻璃凹陷载玻片或染色皿置于解剖显微镜下，并用1x PBS填充孔。
- 用一对镊子抓住下胸部的雌性苍蝇。通过腹部后端没有男性生殖器和前腿上没有性梳子来确保苍蝇的性别，这是次要特征52。使用另一对镊子（步骤2.5）单独解剖苍蝇，同时将它们浸入解剖显微镜下充满1x PBS的孔中（建议放大20倍）。
- 在通过解剖显微镜观察时，使用另一对镊子拉扯苍蝇腹部的后部，使内部器官（例如卵巢，肠道）可见。
- 轻轻挤压苍蝇腹部的前部（如一管牙膏），迫使卵巢离开腹部。这种方法应该保持卵巢完整。拆下并小心地清除其他器官和飞溅的碎片。
- 使用镊子或解剖针，分离卵巢的卵巢，同时保持整个卵巢结构完整。此步骤的目的是打破覆盖卵巢的肌肉鞘，并允许更有效和均匀的染色。
- 快速将卵巢转移到含有1x PBS的1.5 mL微量离心管中，并将管保持在冰上，直到解剖所有苍蝇。如果微管或微丝（或由这些细胞骨架成分运输的水泡）可见，请勿将管保持在冰上，因为这可能导致解聚。
- 一旦所有卵巢被解剖并转移到微量离心管中，让它们沉入管的底部并除去除〜50μL以外的所有PBS。加入1 mL 4%PFA，放在螺母平台摇臂上15分钟。重要的是，检查卵巢是否在固定溶液中来回移动，以允许适当的固定，因为不完全的固定可能导致染色和成像问题。
注意：螺母的速度并不重要。虽然有些螺母具有速度控制，但其他螺母带有预设速度。预设转速足够，如果可调，则设置为40-50 rpm。 - 取出固定溶液（如步骤2.9所示），然后用1mL含有0.1%Triton-X 100（1x PBST）的1x PBS进行两次快速洗涤，方法是轻轻倒置微量离心管5-6次。然后，用1毫升1x PBST（总共40-60分钟）进行四次10-15分钟的洗涤（长洗）。
注意：建议使用1x PBS + 0.1%Triton-X 100进行洗涤，因为增加洗涤剂的百分比可能导致GFP变性，导致荧光降低和检测GFP标记的BM蛋白。 - 对于染料染色，例如DNA和F-肌动蛋白染色，继续执行步骤3。对于免疫染色，请继续执行步骤4。卵巢可以在4°C的1x PBST中储存长达24小时，然后再继续。
3. 标准 DNA/F-肌动蛋白染色
- 固定和洗涤后，取出PBST。加入500μL DNA和F-肌动蛋白染色溶液。为了制备DNA / F-肌动蛋白溶液，将赫斯特（DNA染色剂;1：1000稀释的1mg / mL储备溶液）和荧光团标记的鬼灭英（F-肌动蛋白染色;Alexa Fluor 546的1：500稀释或Alexa Fluor 647的1：100稀释，每种66μM储备溶液）混合在500μL PBST中。
- 用铝箔覆盖试管，使卵巢和染料保持在黑暗中以保持荧光以进行有效成像，并在螺母平台摇臂上孵育15分钟。
- 孵育后，取出DNA / F-肌动蛋白溶液（如步骤2.9所示）。按照步骤2.10中所述，在1x PBST中进行两次快速洗涤和三次长时间（10-15分钟）洗涤。按照步骤 5 中所述继续安装。
4. 荧光免疫染色
注意：这是用于荧光成像的标准免疫染色方案，与大多数一抗兼容。
- 阻断和一抗免疫染色（第1天）
- 固定和洗涤后，按照步骤2.9中所述除去PBST。加入1mL封闭溶液（PBS + 5%BSA），并在螺母平台摇杆上阻断卵巢至少1小时。
注意：除BSA外，还可以将胎牛血清（FBS）或正常山羊血清（NGS）添加到封闭溶液中。或者，卵巢可以在4°C的螺母平台摇杆上阻塞过夜。 - 按照步骤2.9除去封闭溶液，并在封闭溶液中加入300μL含有以适当浓度（对所用抗体特异性）稀释的一抗的一抗溶液。在4°C的螺母平台摇臂上孵育过夜。 第二天，取出一抗溶液并进行二抗免疫染色。
注意：一些一抗可以保存和重复使用。在某些情况下，重复使用的一抗可以减少背景染色，从而获得更好的成像效果。但是，应针对每种抗体测试重复使用以确保效率。
- 固定和洗涤后，按照步骤2.9中所述除去PBST。加入1mL封闭溶液（PBS + 5%BSA），并在螺母平台摇杆上阻断卵巢至少1小时。
- 二抗免疫染色（第2天）
- 除去一抗溶液后，按照步骤2.10进行两次快速洗涤和四次长时间（10-15分钟）洗涤。使用新鲜的1x PBST仔细进行重复洗涤将减少非特异性背景并导致最佳成像。
- 按照步骤2.9除去PBST，并加入500μL含有荧光二抗的二抗溶液，该二抗溶液将检测所使用的一抗。从此时起，通过将其覆盖在铝箔中来保护灯管免受光线的影响，以实现荧光的最佳保存，这对于图像采集和分析至关重要。
注意：二抗溶液应包含与荧光团偶联的二抗，这些荧光团不与内源性标记的蛋白质重叠。例如，如果使用GFP标记的蛋白质，建议使用红色或远红色波长（例如，546，568或647nm）的Alexa Fluor二抗。荧光染料，如赫希斯特和Alexa Fluor 546或647共轭鬼笔环蛋白，可以添加到二级溶液中。这些染色剂可能有助于标记整体细胞结构（即细胞核和F-肌动蛋白）。有关浓度，请参阅步骤3.1。 - 将卵巢在室温下在螺母平台摇杆上的二抗溶液中孵育2小时。按照步骤2.10所示，在1x PBST中进行两次快速洗涤和四次长时间（10-15分钟）洗涤。按照步骤 5 继续安装。
5. 安装染色的卵巢
注意：如果卵巢发育良好且丰富，这种方法效果很好。小心地将卵巢安装在载玻片上对于最佳成像至关重要。
- 最后一次洗涤后，使用p1000移液管轻轻地在管中上下移液卵巢以分离卵室。通过将管子保持在直立位置5-10分钟，让卵室沉入底部。仔细分离各个卵室对于实现最佳图像采集至关重要。
- 使用巴斯德移液器除去PBST，留下约50μL，使用p200移液管尽可能多地去除剩余的PBST。添加两滴安装介质，足以均匀地铺展在 22 mm x 22 mm 盖玻片上。在安装之前，卵巢可以在4°C的微量离心管中的安装介质中储存长达1个月。
注：市面上有几种不同的安装介质。建议使用硬性镶样，如 Aqua-Poly/镶座或 ProLong 玻璃防淬灭贴片剂，以达到最佳的成像条件。不鼓励使用甘油作为安装介质，因为它会导致较差的成像条件（例如，荧光团不稳定）。对于不聚合的安装介质，请使用盖玻片密封剂/指甲油将其密封到位。 - 为载玻片贴上标签，并用柔软无尘的纸张擦拭，以去除灰尘和指纹。切断 p200 移液器吸头的末端，以便将粘性安装介质从微量离心管轻松转移到载玻片上。接下来，将安装介质中的所有卵室慢慢转移到载玻片上，确保不会产生气泡。
- 在解剖显微镜下，使用新的p200尖端或镊子轻轻展开安装介质和分离的卵室，以覆盖大约盖玻片大小的区域。
- 使用镊子，小心地将盖玻片（用无尘纸清洁）以一定角度放在卵室上，以避免气泡。
- 将载玻片在室温下存放在黑暗的平坦表面上2天以进行聚合。一旦安装介质固化，载玻片可以在4°C的黑暗中储存几周以进行成像。
注：在成像之前，硬设置安装介质必须聚合，这一点很重要。如果培养基尚未聚合，卵巢将漂浮在盖玻片下方，影响图像采集。此外，只有在完全设置后才能实现安装介质的最佳反射指数（有关详细信息，请参阅制造商的信息）。 - 替代安装方法：如果卵巢不丰富，建议使用此方法以减少组织损失。在这种方法（如下所述）中，在安装时分离载玻片上的卵室和卵室，而不是按照步骤5.1中所述通过移液在微量离心管中将它们分离。
- 最后一次洗涤后，除去除~100μL以外的所有洗涤溶液。使用巴斯德移液器或p1000移液管，将PBS中完整的卵巢转移到载玻片上。使用 p200 移液器，小心地从载玻片中取出尽可能多的 PBST。如果需要，请使用无尘纸擦拭 PBST。不要触摸卵巢。
- 添加两滴安装介质。使用镊子或解剖针小心地分离卵室和卵室。取出并丢弃多余的组织，然后在安装介质中展开卵室和卵形。继续执行步骤 5.5-5.6。
6. 共聚焦图像采集
注意：本节提供使用任何共聚焦显微镜实现最佳图像采集的关键参数（图2）。
- 设置显微镜并找到样品，如下所述。
- 在成像之前，使用荧光显微镜的目镜定位感兴趣区域（ROI）至关重要。使用低放大倍率物镜（20x）或用于图像采集的物镜（即40x或63x）。选择要成像的卵室。
注：对于图像采集，建议使用40x或63x等高倍率物镜（参见6.2.1）。 - 选择ROI后，继续进行图像采集;对于共聚焦成像，请继续执行步骤 6.2，对于超分辨率成像，请继续执行步骤 7。
- 在成像之前，使用荧光显微镜的目镜定位感兴趣区域（ROI）至关重要。使用低放大倍率物镜（20x）或用于图像采集的物镜（即40x或63x）。选择要成像的卵室。
- 选择关键参数以实现最佳图像采集，如下所述（ 表1给出了代表性图像的关键参数示例）。
- 选择物镜：对于FE中BM蛋白的细胞内运输和分泌的共聚焦图像采集，使用40x或63x物镜。
注意：为了获得最佳分辨率，强烈建议使用具有高数值孔径（NA）的平复消色差物镜，以提供最高的消色差校正。 - 为每个通道/轨道选择激光器：对于GFP，使用激光488 nm;对于DAPI或赫希斯特，使用激光405纳米;对于Alexa Fluor 546或568，使用激光561 nm;对于Alexa Fluor 647，请使用激光640 nm。
注：每次激光选择都会导致不同的通道/轨道形成。这里，术语通道是指由每个通道的特定波长处所选ROI的激发荧光团的强度分布所记录形成的图像。 - 针孔设置：要减少图像采集过程中的失焦光线，请将每个通道的针孔设置为 1 AU。
- 激光强度和探测器增益设置：要微调图像灵敏度，请同时使用探测器主增益和激光功率。要正确设置图像灵敏度，建议使用量程指示器。将主增益和激光功率设置为具有适当的灵敏度，其中目标结构（例如，含BM的囊泡）清晰可见，同时避免探测器饱和。
注：为避免光漂白，请使用所需的最小激光功率。建议首先增加探测器增益，同时使用尽可能低的激光功率。如果探测器增益的增加不能达到所需的强度，则增加激光功率。激光功率强度建议在0.5%-1.2%之间。 - 帧尺寸：建议使用采集软件确定的最佳图像尺寸。对于大多数应用程序，请使用 1024 x 1024 的最大分辨率。更高的分辨率将显著增加采集时间。
- 扫描速度：使用6-9之间的扫描速度，这对于大多数样品是安全的。如果样品有噪声，请使用较慢的扫描速度来提高信噪比。但是，低扫描速度会增加光漂白和采集时间。
- 平均强度平均：要提高图像质量， 请通过 具有相同设置的连续扫描使用平均强度平均值。在大多数情况下，使用平均值 2 来改善信噪比，而无需对样品进行光漂白。
- 缩放：使用缩放功能调整扫描区域。使用2x-4x之间的变焦，同时使用40x和63x物镜作为最有效的值，以清楚地可视化FE中含有BM的囊泡。仔细选择最小的投资回报率，以减少采集时间。
- 选择物镜：对于FE中BM蛋白的细胞内运输和分泌的共聚焦图像采集，使用40x或63x物镜。
- 要使用蔡司禅软件获取 z 轴堆栈，请使用以下 Z 切片参数并按如下所述进行设置。
注意：囊泡和其他含有BM蛋白的细胞内结构是3维（3D）结构。通过 FE 获取 z 轴堆栈将显著提高图像质量和分辨率。通常，跨越组织厚度/深度的范围足以有效地可视化细胞内定位。为了获得最佳的3D重建，建议使用软件确定的最佳间隔。对于 40x 和 63x 物镜，避免每个 z 形截面之间的间隔大于 0.5 μm，以实现最佳的 3D 重建。- 单击“购置”选项卡下主区域中的 z-Stack 复选框。为 z-stack 选择“每片所有轨迹”扫描模式。这将导致每个 z 位置切片的通道轨迹发生变化。
- 选择所需的通道以观察标本，然后单击 “实时 ”开始实时扫描。建议使用检测GFP标记的BM蛋白所需的通道。
- 按所述设置 z 堆栈的范围。使用显微镜上的微调旋钮，找到标本一端的z轴位置，然后单击“ 设置优先”。同样，找到标本另一端的 z 轴位置，然后单击“ 设置最后一个”。
- 对于z-stack中的每个位置，分别单击每个通道，选择范围指示器，然后根据需要调整激光强度和主增益，如步骤6.2.4中所述。
- 按照步骤 6.3 下方的注释中的建议，设置 z-stack 分配步长的间隔以分配步长。单击 “开始实验” 以开始 z 堆栈采集。
7. 超分辨率图像采集
- 选择与艾瑞斯扫描兼容的物镜。为了可视化BM蛋白的细胞内定位，使用63x油物镜是最佳的（图3）。将物镜设置为63倍，并在镜头上轻轻滴一滴浸油。将载玻片放在物镜上，盖玻片朝向物镜以定位标本。
- 选择具有适当设置的配置，以便对要成像的荧光基团进行成像，如下所述。
- 单击“获取”选项卡中的“智能设置”按钮以配置新实验。选择艾利斯扫描（超分辨率）;选择此选项后，将需要在分辨率（空气扫描 SR）、SNR/灵敏度（空气扫描共聚焦）和速度（多路复用 SR-2Y）之间进一步选择。对于固定组织，请选择“分辨率”，因为这样可以获得最佳采集效果。
- 单击“配置实验”框中的 +以添加曲目/频道。从染料数据库中选择特定染料的轨迹。对于多通道实验，请根据需要通过选择适当的染料来添加每个轨道。
- 添加完所有磁道后，选择软件提供的实验方案之一。对于此实验，请使用 最佳信号，因为尽管与最智能（线）建议相比，速度会慢一些，但它将为每种染料创建最佳硬件设置，从而产生最大的信号增益和最小的发射串扰。设置并加载实验后，它将出现在“成像设置”窗口的“采集”选项卡中。
- 选择智能设置后，将自动选择探测器GaAsP-PMT的波长范围。通过移动底部的滚动条来调整范围，以增加或减少范围，或者根据需要将范围完全移动到另一个区域。使用它来确保两个不同通道的范围不重叠，以避免串扰。保存配置以供将来重复使用。
- 设置配置后，继续调整缩放和扫描区域，如步骤 6.2.8 所示。优化扫描区域以专注于感兴趣的区域，从而减少扫描时间和存储空间。继续获取图像。
- 对于每个单独的频道，请在 频道下选择 一个轨道，然后单击 直播。按照步骤6.2.4中所述，使用范围指示器工具调整主增益和激光功率，并遵循上述所有准则以避免饱和像素。通过单击 Airyscan 探测器视图按钮，确认六边形探测器视图居中并对齐。在大多数情况下，六边形探测器视图会自动居中并对齐。对其他通道重复上述步骤。
- 在采集模式切换窗口中 的“图像大小”下，单击 SR （超分辨率限制像素数）以最大化探测器的功能。这将自动调整帧大小。
- 将平均值保持为 “无” ，因为通常没有必要，这将减少扫描时间。在某些情况下，平均2x可以提高信噪比。
- 收集具有 8 位数据深度的原始数据。单击 “捕捉 ”以获取图像。要获取 z 堆栈，请执行步骤 6.3。
- 执行图像处理，如下所述。这将生成一个 16 位图像。
- 获得图像或 z 堆栈后，单击“ 处理>方法 ”，然后选择“ Airyscan 处理”。
- 首先执行自动过滤器，并通过更改SR值来执行进一步的手动处理，以获得样品的最佳结果。确定最佳 SR 值后，单击“ 应用 ”以生成已处理的图像。对于 z 轴堆栈图像，通过单击“3D 处理”框，将处理为一个 z 切片（当前图像 [2D]）或作为整个 z 轴堆栈 进行处理 。
8. 图像处理和数据分析（正交投影、3D重建和强度剖面图）
注意：对于此方法，Zen 软件描述了用于生成正交投影、3D 重建和强度分布的步骤（请参见 材料表）。类似的数据分析也可以使用ImageJ软件56执行。
- 执行正交投影，如下所述（图 4）。
- 使用共聚焦或超分辨率显微镜获得z-stack后，生成正交投影以在2D视图中查看细胞z轴中的囊泡（与3D重建相比）。为此，请单击“ 处理>方法”， 然后选择“ 正交投影”。
- 在参数下，选择所需的投影平面。对于 z 轴（z 轴堆叠）的投影，请选择 正面 （XY） 平面。在“ 方法”下，选择“ 最大值 ”以获得最高质量的投影。
- 接下来，通过选择起始位置（起始 z 切片）来确定投影的厚度，并确定投影中的厚度（z 切片的总数）。理想的选择厚度等于 z 轴中一个像元的厚度。
- 设置参数后，单击“ 应用 ”以 XY 平面方式创建 z-stack 的投影。
注意：创建多个 z-stack 的正交投影以比较特定感兴趣对象的数量时，必须保持投影的厚度相同（或尽可能接近）以确保数据准确性。
- 执行3D重建，如下所述（图5）。
- 创建 z 堆叠的 3D 重建，以观察结构的定位和形状。对使用共聚焦和超分辨率方法获取的 z 堆栈执行此操作。首先使用 3D 处理处理超分辨率 z 堆栈，如步骤 7.8 中的 3D 重建。
- 要生成 3D 图像，请单击预览窗口中的 3D 图标。单击后，3D选项卡将出现在屏幕下半部分的显示控制部分中。3D 视图（如“透明度”、“体积”、“最大值”、“表面”和“混合”）将可见。查看囊泡结构时使用表面视图或混合视图（首选）。
- 要获得最高质量的图像，请选择“ 精确 ”设置，因为最快的设置将不太准确，并导致较差的 3D 渲染。
- 生成图像后，通过旋转和缩放对其进行操作，以聚焦在首选位置以查看感兴趣的对象。在 “外观 ”选项卡下操作 3D 图像。
- 获得满意的视图后，在“3D”选项卡下，选择“ 显示的分辨率”，然后单击“ 创建图像”。这将以与查看图像相同的方向创建图像的快照，并且可以以各种文件格式保存和导出。
- 生成如下所述的强度曲线（图7）。
注意：与不同荧光信号相关的像素的分布和强度分布可以被视为叠加图像，以确定它们的共定位。- 通过共聚焦或超分辨率成像获取最佳图像后，在“预览”窗口的“视图”面板中，单击“配置文件”。在预览窗口中，将出现一个直方图，将强度分布显示为距离的函数，以及一个显示距离和强度值的表格。
- 在屏幕底部的显示控件区域中，单击“配置文件定义”选项卡中的箭头工具。沿需要评估不同像素的强度分布的对象的长度绘制一个箭头。要绘制箭头，请放大图像。
- 强度配置文件将显示在图像预览的左侧，其中将显示沿箭头路径的距离和相应的峰值。要删除图像本身上显示的直方图，请取消选中 在图形中显示配置文件 框。
- 在显示控制区域的“ 尺寸 ”选项卡中，取消选择强度配置文件中未包含的任何通道。
- 在“图形”选项卡中，双击“注释/测量”框下显示的“配置文件”以打开“设置图形元素格式”弹出框。使用此选项可以更改箭头的颜色及其样式和描边粗细。选择所需设置后关闭该框。
- 单击“ 配置文件视图 ”选项卡。在新图像部分中，单击“ 当前视图”， 然后单击 “另存为” 以保存文件。建议将文件另存为.tif文件，以避免数据压缩和丢失。
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Representative Results
本文描述的方法可用于有效和准确地成像和表征极化上皮细胞中BM蛋白的细胞内运输和分泌，例如 果蝇 卵巢的FE。接下来，我们提供使用所述方法获得的预期结果，以及有用的建议和潜在的陷阱。为此，使用内源性标记的Vkg（果蝇 Col IV）的Vkg-GFP。然而，其他内源性标记的BM蛋白（如Pcan-GFP）可以达到相同的结果。
设置最佳采集参数（图2）
为了准确表征上皮细胞中BM蛋白（例如Vkg和Pcan）的细胞内运输和分泌，按照提供的方法中所述正确设置共聚焦显微镜的采集参数至关重要。
使用共聚焦显微镜，可以在分泌之前检测到Vkg-GFP的细胞内定位并将其基底沉积在FE中（图2A）。已经表明，在ER中翻译后，Coll IV被运输到高尔基体，然后被包装成细胞内外囊泡。使用这种成像方法，我们观察到Vkg-GFP积聚在具有不同形状的细胞内隔室中，可能代表不同的细胞器，内体室和囊泡类型（图2A，箭头）。在外吞囊泡中，Coll IV已经组装成由三种多肽组成的原纤维：两个α1链和一个α2链（ 果蝇中的Vkg），导致拉伸囊泡的形成，也可以使用共聚焦成像进行可视化（图2A，箭头）。然后，Coll IV从上皮细胞特异性分泌基底，并将其沉积在BM中（图 2，箭头）。
如果采集参数设置不正确，则无法精确观察BM蛋白细胞内运输过程中的不同形态和位置（图2B，C）。例如，如果对采集参数进行优化以可视化细胞外BM而不是细胞内结构，则含BM蛋白的内体区室和囊泡（此处用Vkg-GFP标记）显得暗淡或不可见（图2B）。相反，如果检测器过饱和，则可以在最佳条件下检测到Vkg-GFP的细胞内定位（比较 图2A 和 图2C），但背景荧光噪声的增加使得BM蛋白定位的解释更加困难，特别是对于共定位实验（见 图7).总体而言，这些数据说明了适当的采集参数对于实现上皮细胞中BM蛋白准确定位的重要性。
设置最佳超分辨率和解卷积参数（图3）
如共聚焦图像采集所示，在使用超分辨率显微镜时正确设置采集参数以避免饱和度不足或过高也至关重要。这种超分辨率成像方法还涉及仔细配置反卷积参数以实现超分辨率成像（图3）。当反卷积处理得到最佳配置时，超分辨率成像可显著提高含有BM蛋白的细胞内结构（图3A，箭头）的分辨率，例如囊泡或高尔基体结构（图3A 和 图7C），BM本身（图3A，箭头），并提高信噪比45.与共聚焦显微镜相比，超分辨率显微镜在所有三个空间维度上的分辨率提高了约2倍。与使用标准CSLM拍摄的图像相比，使用超分辨率成像拍摄的BM的细胞内运输的更清晰的图像清楚地说明了分辨率的提高（比较 图2A 和 图3A）。
如果反卷积参数设置不正确，则无法以最佳方式实现超分辨率，并且会失去分辨率的提高。超分辨率图像的处理不足导致图像模糊，导致BM蛋白的细胞内定位显得暗淡，并且不像在最佳条件下那样定义明确（将 图3B 与 图3A进行比较）。相反，图像的过度处理导致颗粒状图像，其中BM蛋白的细胞内定位出现像素化（图3C）。这些数据强调了使用适当的反卷积参数来获得反映BM蛋白细胞内分布的有意义和代表性的图像的重要性。
总而言之，与共聚焦显微镜相比，这些数据清楚地显示并突出了使用超分辨率图像处理提高BM蛋白细胞内运输的分辨率。具体而言，这种方法可以通过增强所涉及的细胞内结构的分辨率来更好地可视化BM蛋白的细胞内运输。这允许比较结构的不同大小和形状，以更好地识别和表征参与FE中BM蛋白极化沉积的新因素。
通过有限元对光学z切片（z-stack）进行正交投影和3D重建，以增强BM蛋白细胞内分布的可视化（图4 和 图5）
由于BM蛋白的细胞内分布在3D（x，y和z轴）的整个FE中，因此使用超分辨率或共聚焦显微镜通过FE的光学z切片的正交投影和/或3D重建可用于评估BM蛋白在野生型或突变细胞内的定位和分布（例如，在 图4 和 图5中）。
正交投影允许在单个平面中投影所有获得的 z 截面。该方法对于使用共聚焦（图4A）或超分辨率（图4B）成像在单个图像中显示含有BM蛋白的囊泡和隔室的整体分布特别有用。然而，与共聚焦显微镜相比，使用超分辨率显微镜时，分辨率明显更好，背景噪声更小（比较 图4B 和 图4A）。
可视化含BM的隔室和囊泡的整体分布的另一种方法是通过共聚焦（图5A）或超分辨率（图5B）成像组装一堆光学z切片来生成3D重建。这种方法还可以非常有效地评估细胞内BM蛋白的定位和分布以及含有Vkg-GFP的区室和囊泡的形状，特别是在使用超分辨率显微镜时（图5）。与超分辨率（图5B）相比，传统的共聚焦显微镜（图5A）会产生更高的背景噪声，而在3D渲染中考虑这些背景噪声可能会导致伪影。此外，共聚焦的较低分辨率也导致创建的图像不如超分辨率生成的图像平滑和清晰（比较 图5A 和 图5B）。
使用超分辨率成像表征与BM蛋白偏振分泌中涉及的组分损失相关的表型（图6）
如目前所示（图2， 图3， 图4和 图5），超分辨率显微镜和图像处理可用于评估 果蝇 卵巢野生型FE中BM蛋白的细胞内定位和分布。此外，这种方法还可用于确定和比较BM蛋白在突变或敲低条件下的定位。因此，这是一种有效的方法来表征新发现的组分的作用，这些组分专用于BM蛋白的极化细胞内运输，分泌和沉积。
GTP酶交换因子（GEF）岩已被证明是专用于BM蛋白28极化沉积的生物途径中的关键组成部分。在 碎石 敲低FC中，BM蛋白在顶端和基底均积聚，表明克拉格控制着BM蛋白如Vkg-GFP的极化分泌（图6）。使用超分辨率显微镜可以更好地表征由Crag丢失引起的表型。例如，在 碎石敲低FC中观察到BM蛋白的强顶端积累以及异位顶端BM的组织（图6B，箭头）。此外，当表型不那么异常时，检测到在FC的小斑块中顶端积聚的BM膜（图6B，箭头）。总而言之，这些数据表明，超分辨率显微镜可用于表征突变表型，以更好地了解BM偏振沉积中涉及的组分的作用。
使用抗体和内源性标记的BM蛋白的共定位实验，使用共聚焦和超分辨率显微镜成像（图7）
最后，使用针对特异性细胞内标记物或新鉴定的组分的抗体与内源性标记的BM蛋白结合，可用于更好地表征极化上皮中BM蛋白的细胞内运输和分泌。GM-130是一种顺式高尔基体标记物，用于说明这一点。在被包装在分泌囊泡中之前，Coll IV被运送到高尔基体。当使用共聚焦（图7A，B）或超分辨率（图7C，D）成像评估Vkg-GFP的亚细胞分布时，两种方法都表明Vkg-GFP部分与GM-130共定位，确认Colil IV在分泌前被分选到高尔基体。然而，在使用超分辨率成像时，观察到Vkg-GFP和GM130之间的信噪比增加和共定位分辨率更好（将图7A与图7C进行比较）。
此外，当通过共聚焦（图7B）和超分辨率（图7D）显微镜测量光学切片的荧光强度来量化绿色（Vkg-GFP）和红色（GM-130）像素的空间分布和水平时，观察到Vkg-GFP和GM-130的共定位。Vkg-GFP和GM-130像素的分布以直方图绘制，其中Vkg-GFP和GM-130峰的重叠表示它们的共定位（图7B'，D'）。因此，使用这种图像分析工具，可以精确地确定Vkg-GFP在特定细胞内区室中的位置。然而，将共聚焦图像（图7B'）生成的直方图与超分辨率（图7D'）图像进行比较，证实了超分辨率显微镜产生更好的结果，从峰值强度较高和背景噪声降低可以看出，因为缺少较小的峰值（比较 图7B' 和 图7D'） 与超分辨率生成的直方图相关联。总而言之，这些数据表明，尽管共聚焦显微镜可用于量化共定位，但超分辨率是一种更强大的方法，可以更有效，更准确地量化定位。
图1： 果蝇 卵巢的滤泡上皮（FE）：研究基底膜（BM）蛋白极化沉积的模型系统。 （A）用荧光立体显微镜拍摄的解剖和切除后完整卵巢的图像。卵巢表达一种内源性 GFP 标记的 BM 蛋白 （Vkg-GFP）。比例尺= 1 mm.（A'）雌性苍蝇的两个卵巢附着在输卵管上。每个卵巢包含16-20个卵巢。勾勒出单个卵巢（矩形）。比例尺= 1毫米（B）纵向切片，用共聚焦显微镜拍摄，通过表达Vkg-GFP的卵巢，并染色DNA（蓝色）和F-肌动蛋白（红色）。卵形虫由不同阶段的卵室组成。卵室由围绕种系细胞（GC）的单层滤泡上皮（FE）组成。FE合成并基底分泌BM蛋白（例如，平锰和Vkg）。比例尺 = 100 μm. （C） 有限元示意图。FE是一种典型的上皮细胞，具有明显的顶基极性，其中顶端结构域面向种系细胞，基部结构域面向BM（绿色）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：使用共聚焦成像（A-C）纵向切片通过表达Vkg-GFP（绿色）的卵室并染色DNA（蓝色）和F-肌动蛋白（红色）进行成像，对BM蛋白的细胞内运输进行成像。（自动-中）使用共聚焦显微镜显示含有Vkg-GFP（箭头）的细胞内隔室和囊泡，以及基底和细胞外沉积的BM（箭头）。（A）最佳获得的图像，其可见Vkg-GFP的细胞内运输。（A'）Vkg-GFP定位于不同细胞区室（例如高尔基体）和囊泡中的FC细胞质中。由于胶原IV的原纤维组织，含有Vkg-GFP的囊泡出现细长（箭头）。（B）曝光不足的图像，其采集参数经过优化，以可视化细胞外BM，而不是BM蛋白的细胞内分布。Vkg-GFP（绿色）在整个细胞质（B'）中显得暗淡，与（A）相比，导致含有Vkg-GFP的囊泡无法检测到。（C）GFP检测器饱和的过度曝光图像，导致背景荧光增加。虽然Vkg-GFP（绿色）的细胞内分布可以局限于整个FC的细胞质（箭头），但过度暴露导致成像伪影，其中细胞内结构看起来比它们更大，如（A-A'）。比例尺 = 5 μm.请点击此处查看此图的大图。
图3：使用超分辨率成像和处理对BM蛋白的细胞内运输进行成像。 （自动对照）通过表达Vkg-GFP（绿色）的卵室的纵向切片，并染色DNA（蓝色）和F-肌动蛋白（红色）。（A）最佳处理的超分辨率图像，其中清楚地观察到Vkg-GFP的细胞内运输。（A'）Vkg-GFP位于不同细胞区室（例如高尔基体）和水泡（箭头）和BM（箭头）的FC的整个细胞质中。（B）未充分处理的图像导致比（A）中更高的背景荧光。Vkg-GFP（绿色）的细胞内定位显得暗淡且不太明确（将B与A进行比较）。（C）过度处理的图像导致Vkg-GFP的细胞内定位出现像素化和颗粒状的图像。比例尺 = 5 μm .请点击此处查看此图的大图。
图4：使用共聚焦和超分辨率显微镜方法获取和处理的z-stack的正交投影（A-B）通过表达Vkg-GFP（绿色）的卵室的光学z切片的正交投影，并使用共聚焦（A）或超分辨率（B）显微镜染色DNA（蓝色）和F-肌动蛋白（红色）。（A） 使用最佳共聚焦参数获取的 z-stack 投影。Vkg-GFP的细胞内定位可以在FC的整个z轴（A'，箭头）中观察到。BM也是可见的，看起来非常明亮（A'，箭头）。（B） 使用最佳超分辨率处理获取的 z 轴堆栈的投影。在FC（B'，箭头）的整个z轴上可以观察到含有Vkg-GFP的明确定义的细胞内区室和囊泡。BM也非常明确（B'，箭头）。标准共聚焦成像和超分辨率成像之间的区别是显而易见的，因为使用超分辨率显微镜时，Vkg-GFP和BM的细胞内定位明显更明确。此外，共聚焦显微镜拍摄的图像具有更高的背景荧光。比例尺 = 5 μm.请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用共聚焦和超分辨率显微镜方法获取和处理的 z 堆栈的 3D 重建 （A-B） 表达 Vkg-GFP（绿色）的蛋室的 z 堆栈（混合视图）的 3D 渲染，并针对 DNA（蓝色）和 F-肌动蛋白（红色）进行染色。（A）通过共聚焦显微镜获得的z堆栈的3D渲染。在整个细胞（A'）中可以看到含有Vkg-GFP的隔室和囊泡的位置和形状。（B） 通过最佳超分辨率处理获取的 z 堆栈的 3D 渲染。可以看到含有Vkg-GFP的隔室和囊泡的位置和形状（B'）。囊泡的形状以及BM和原子核的形状被平滑地定义，并且与共聚焦显微镜相比（比较B'和A'）的分辨率更高。含有Vkg-GFP的隔室和囊泡的形状和大小也可以使用超分辨率显微镜更好地确定（比较B'和A'）。请点击此处查看此图的大图。
图 6：在岩壁击倒的 FC 中 Vkg-GFP 定位的表征。 （A-B）通过表达Vkg-GFP（绿色）的卵室的纵向切片，染色DNA（蓝色）和F-肌动蛋白（红色），并通过最佳超分辨率处理获得。（A）表达野生型碎石的对照线，这是一种对BM适当沉积至关重要的蛋白质。FE显示典型的BM蛋白定位，其中Vkg-GFP在细胞内分布并基底沉积在FE（A'）中。（B）转基因果蝇线表达RNAi在FE中的碎石，导致碎石敲低。碎石的丢失导致BM蛋白（例如Vkg-GFP）在FE（B'，箭头和箭头）中顶端错位。超分辨率图像用于表征与Crag丢失相关的BM错位表型。具体而言，一些碎岩RNAi FC显示出BM蛋白（B'，箭头）的强顶端错位，而其他岩礁RNAi FC呈现较弱的顶端错位（B'，箭头）。超分辨率成像清楚地揭示了与岩屑丢失相关的表型（B'，箭头与箭头）。比例尺 = 5 μm.请点击此处查看此图的大图。
图 7：使用共聚焦和超分辨率显微镜方法对 Vkg-GFP 和 GM-130（高尔基体标记物）进行共定位 （A-D） 通过表达 Vkg-GFP 的卵室进行纵向切片，并对顺式高尔基体标记物（GM-130，红色）进行免疫染色，使用共聚焦 （A，B） 或超分辨率 （C，D） 显微镜成像。（一、二）共聚焦成像显示细胞内Vkg-GFP部分与顺式高尔基体标志物（A，箭头）共定位。（B） （A） 的放大区域。沿白色箭头的绿色 （Vkg-GFP） 和红色 （GM-130） 像素的分布以直方图 （B'） 绘制。直方图的 x 轴表示沿箭头的距离 （μm），而 y 轴表示像素强度。重叠的绿色和红色峰（*）显示了Vkg-GFP和GM-130共定位的位置。（三、四）超分辨率成像还表明，细胞内Vkg-GFP部分与顺式高尔基体标志物（C，箭头）共定位。（D） （C）的放大区域。沿白色箭头的绿色 （Vkg-GFP） 和红色 （GM-130） 像素的分布以直方图 （D'） 绘制。直方图的 x 轴表示沿箭头的距离 （μm），而 y 轴表示像素强度。重叠的绿色和红色峰（*）显示了Vkg-GFP和GM-130共定位的位置。这些数据表明，超分辨率成像是一种比共聚焦成像更有效、更精确的方法来表征和量化共定位。比例尺 = 5 μm.请点击此处查看此图的大图。
表1：代表性图像的共聚焦和超分辨率显微镜采集和处理参数。 所有主要成像参数都针对所提供的代表性图像进行编译。 请按此下载此表格。
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Discussion
BM对于胚胎和器官形态发生以及成人生理功能至关重要。此外，BM作为建立和维持上皮极性的信号平台，并为组织提供支持2。然而，调节BM蛋白正确放置的机制知之甚少。要更好地了解专门用于BM蛋白细胞内运输和极化分泌的生物途径，需要仔细分析这些途径的成分及其在BM加工中的作用。实现这一目标的一种方法是使用共聚焦和超分辨率成像。在这里，我们描述了用于制备和染色或免疫染色 果蝇 卵巢的方法，以使用共聚焦和超分辨率显微镜有效地对FE中BM蛋白的细胞内运输和分泌进行成像。
蛋白质捕获和内源性标记蛋白质在野生型和突变条件下可视化BM蛋白细胞内运输和分泌的优势
所提供的方案充分利用蛋白质陷阱和内源性标记的BM蛋白（例如，Vkg-GFP和Pcan-GFP）来成像和评估FE中BM蛋白在野生型（对照）和突变条件下的定位和分布。与使用针对BM蛋白的抗体相比，这些品系具有重要优势。首先，针对目标特定蛋白质的抗体通常很少见且丰度低。此外，通常存在与抗体相关的组织外显率问题，这可能导致对目标蛋白质的不准确观察和评估。此外，蛋白质陷阱谱系可以插入到不同的遗传背景中，用于确定BM正确沉积所需的因子的功能，例如（i）操纵基因表达的方法（例如UAS / Gal4），（ii）突变体和（iii）RNA干扰（RNAi）谱系。最后，这些蛋白质阱可用于使用实时成像57可视化BM的定位和功能。
然而，荧光标签与目标蛋白质的融合会干扰其定位和功能。因此，评估标签对蛋白质的任何异常影响至关重要。确保添加荧光标签不会干扰BM蛋白的功能和定位的一种方法是确定转基因 果蝇 系是否纯合可行。在这里和之前描述的不同实验中使用的Vkg-GFP和Pcan-GFP谱系都是纯合子可行的，表明添加GFP标签不会干扰这些必需蛋白质的功能29，30。
组织制备、固定和染色对成像的重要性
为了有效和准确地对FE进行成像，按照该方法的指示正确制备，固定和染色卵巢组织至关重要。首先，解剖后，小心地去除所有其他器官，并在固定前飞溅碎屑。建议使用多聚甲醛（PFA）来固定组织，因为它会导致明亮的GFP荧光，并且与大多数抗体相容。然而，PFA可能不与所有抗体相容;有些可能需要戊二醛或甲醇固定。此外，为避免由于一抗的非特异性结合而引起的背景荧光，应将卵巢组织在封闭溶液中在螺母平台摇臂上孵育至少1小时，并在一抗和二抗孵育后广泛洗涤数次，如方案中所述。最后，卵巢组织的正确安装对于实现最佳成像至关重要。这需要小心地分离各个卵室，以避免它们堆叠在一起。在成像之前，让安装介质完全聚合也很重要，以避免组织漂浮在盖玻片下。这进一步使安装介质达到其最佳反射指数，这对于超分辨率成像非常重要。如果不这样做，将影响图像质量。此外，在荧光淬灭之前，制备的载玻片可以在4°C下储存长达1个月。除了提供的方案外，其他几种方案可用于卵巢解剖和染色53，54，55。
使用适当的采集和处理参数对于最佳成像以及使用共聚焦和超分辨率成像评估BM蛋白的定位至关重要
如前所述，正确设置共聚焦和超分辨率成像的采集参数以获得标本的最佳图像至关重要。对于图像采集，必须使用缩放功能仔细选择ROI，然后以最佳方式设置帧大小和采集速度。此外， 如图2所示，适当调整激光功率和检测器增益以可视化细胞内运输而不使检测器饱和至关重要。必须非常仔细地设置这些参数，以避免图像曝光不足或曝光过度（图2）。曝光不足的图像将导致低分辨率图像，其中细胞内结构将难以可视化和表征（图2B）。由于探测器饱和而导致的图像过度曝光，导致数据误解和共定位伪影（图2C）。如果目的是确定内源性标记的BM蛋白的水泡定位，则来自基础BM中GFP标记蛋白（例如Vkg-GFP和Pcan-GFP）的荧光会迅速使检测器饱和。然而，含有较少GFP标记的BM蛋白的水泡将显得暗淡。因此，重要的是使用含BM的细胞内结构（例如囊泡）而不是在BM上设置图像灵敏度（图2）。选择针孔尺寸也非常重要。理想情况下，应为每个通道选择1 AU的针孔大小以获得最佳质量图像，特别是当z轴的分辨率很重要时。较小的针孔尺寸是较薄光学部分的最佳选择。但是，当不需要最佳 z 轴分辨率或未捕获 z 轴堆栈时，可以增加针孔大小以避免光漂白。此外，对于非常暗淡的信号，由于信噪比更高，捕获更多光子，增加针孔尺寸可能会有所帮助，有助于数据解释。
对于超分辨率成像，应特别注意反卷积处理，以避免生成分辨率较差的处理不足或过度处理的图像，如图 3所示。最后，为了实现最佳的3D重建，强烈建议设置由软件确定的最佳间隔。z切片之间的间隔太大（即高于0.5μm）将导致3D渲染不良，并会影响随后的表型分析。
与传统共聚焦显微镜相比，超分辨率在成像BM细胞内运输时的优势
如结果部分所示，尽管可以使用共聚焦成像准确评估BM蛋白的定位和分布，但所描述的超分辨率方法可以生成更精确的成像数据，并且含有BM蛋白的细胞内结构的分辨率显着提高，并且信噪比增强。此外，这种超分辨率显微镜技术相对容易使用。由于超分辨率成像与共聚焦显微镜相比显着提高了分辨率，x轴和y轴高达120nm，z轴高达350nm，这种方法将通过更准确地表征上皮细胞（如FC）中BM蛋白的细胞内运输和分泌来极大地影响我们对BM偏振沉积的理解。
此外，另一种超分辨率成像方法（结构化照明显微镜，SIM）和使用专为点扫描共聚焦显微镜设计的反卷积算法（即尼康的增强分辨率软件模块）以前已被用于表征BM沉积29中涉及的因素的作用。与这些技术相关的分辨率提高为我们理解BM蛋白的细胞内运输和BM的组织提供了关键的见解。然而，与艾瑞斯堪显微镜相比，这些方法存在一些局限性。例如，在获取组织深处的光学z切片时，SIM在获取最佳图像方面不是很有效。这使得SIM在筛选BM沉积中涉及的新组件时难以使用。此外，使用应用于共聚焦图像的反卷积算法无法达到相同的超分辨率水平。总体而言，固定组织的Airyscan超分辨率成像是研究BM细胞内运输和沉积的强大而卓越的方法。
然而，与任何其他超分辨率显微镜一样，这种方法也存在一些不便之处，需要在成像时加以考虑。首先，超分辨率模式通常需要比共聚焦模式更长的样品采集时间。因此，必须仔细设置采集参数和感兴趣区域，以尽量减少样品的光漂白。此外，超分辨率显微镜生成的图像文件比共聚焦显微镜生成的文件大得多，可能需要专门的计算机或服务器进行图像处理和存储。
最后，在 果蝇 卵子发生过程中对BM蛋白的实时成像已被用于表征参与BM极性57的新因素。然而，这种方法有局限性，特别是在BM蛋白运输过程中细胞内结构的分辨率方面。超分辨率显微镜是一种与实时成像结合使用的强大方法，可精确确定已识别因子在BM蛋白偏振沉积中的作用。
该方法的其他应用是研究专用于使用内源性标记蛋白和超分辨率成像的水泡运输的细胞内组分的定位
组织和器官在发育过程中和成年生物体中的建立和维持部分依赖于细胞间信号传导以及细胞张力和粘附。这些过程取决于细胞内运输、内吞作用、胞吐作用和特定蛋白质的分泌。因此，本文中描述的使用内源性标记蛋白和共聚焦和超分辨率显微镜破译BM细胞内运输的方法可以很容易地适应于研究每个过程。此外，CRISPR / Cas9介导的基因编辑的易用性，可生成内源性标记的蛋白质，这使得这种方法更加通用和强大58。
总之，我们描述了使用共聚焦和超分辨率显微镜制备和成像 果蝇 卵巢FE中BM蛋白的方法。这些实验方案可用于高通量筛选，以鉴定专用于BM蛋白正确放置的新组分。最后，这种方法的运用有可能为我们理解上皮细胞如何控制BM蛋白的极化分泌做出重大贡献，这是建立和维护上皮结构的关键过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢朱莉·默克尔对手稿的有益评论。这项工作得到了NIH授予O.D.R15GM137236的支持。共聚焦和超分辨率图像是使用蔡司LSM 900和艾瑞斯扫描2拍摄的，由NSF MRI授权2018748购买。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
References
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