Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Confocal og Super-Resolution Imaging av polarisert intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner under Drosophila Oogenese

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

Kjellermembranen er avgjørende for vev og organmorfogenese under utvikling. For bedre å forstå mekanismene som fører til riktig plassering av denne strukturen, beskriver protokollen som presenteres metoder for å visualisere og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner i epitelceller ved hjelp av konfomisk og superoppløselig mikroskopi.

Abstract

Kjellermembranen (BM) - et spesialisert ark med ekstracellulær matrise tilstede på basalsiden av epitelceller - er avgjørende for etablering og vedlikehold av epitelvevmorfologi og organmorfogenese. Videre er BM avgjørende for vevsmodellering, som fungerer som en signalplattform, og gir eksterne krefter til å forme vev og organer. Til tross for de mange viktige rollene som BM spiller under normal utvikling og patologiske forhold, er de biologiske veiene som kontrollerer den intracellulære smuglingen av BM-inneholdende vesikler og hvordan basal sekresjon fører til polarisert avsetning av BM-proteiner dårlig forstått. Follikulær epitel av Drosophila eggstokken er et utmerket modellsystem for å studere basal avsetning av BM membran proteiner, som det produserer og utskiller alle viktige komponenter i BM. Confocal og super-oppløsning avbildning kombinert med bildebehandling i faste vev gjør det mulig å identifisere og karakterisere cellulære faktorer spesielt involvert i intracellulær trafficking og avsetning av BM proteiner. Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for farging og avbildning av BM-inneholdende vesicles og avsatt BM ved hjelp av endogenet merkede proteiner i follikulær epitel av Drosophila eggstokken. Denne protokollen kan brukes til å håndtere både kvalitative og kvantitative spørsmål, og den ble utviklet for å imøtekomme screening med høy gjennomstrømning, noe som muliggjør rask og effektiv identifisering av faktorer som er involvert i polarisert intracellulær smugling og sekresjon av vesikler under epitelvevsutvikling.

Introduction

Kjellermembranen (BM) er et tynt ark med lagdelt celletilknyttet ekstracellulær matrise (ECM) som er kritisk for epitelstruktur og morfogenese1. Den består av ~ 50 proteiner og finnes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelceller, og omkranser skjelett-, glatt- og hjertemuskelceller og adipocytter 1,2,3. De tre hovedkomponentene i BM på basalsiden av epitelcellene er Kollagen IV, Perlecan og Laminins. BM ligger til grunn for epitelcellene og er ansvarlig for mange funksjoner, inkludert vevsseparasjon og barriere, vekst og støtte, og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplattform regulerer morfologi og differensiering av epitelceller og vev under utvikling 3,13,14. Videre er feilregulering av BM og / eller et brudd i integriteten hovedårsakene til mange patologiske forhold, inkludert tumormetastase 2,15,16. Til tross for de essensielle funksjonene som utføres av BM under vev og organmorfogenese, er komponentene i de biologiske banene dedikert til polarisert intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner vagt kjent.

For å studere intracellulær smugling av BM-inneholdende vesikler og sekresjon av BM-proteiner ved epitelceller, er follikulær epitel (FE) av Drosophila eggstokken et kraftig modellsystem (figur 1). En Drosophila eggstokk består av 16-20 lange, rørlignende strukturer, kalt ovarioles (Figur 1A, B) 17,18,19. Hver ovariol kan betraktes som en eggmonteringslinje, med aldersprogresjonen av eggkamre (som hver gir opphav til et egg) som begynner i den fremre enden og beveger seg bakre, til det modne egget kommer ut gjennom ovidukten. Hvert eggkammer er innkapslet av FE, en monolayer av somatiske follikkelceller (FCs), som omgir de sentrale bakteriecellene (GCs). FE er svært polarisert med en distinkt apikal-basal polaritet der det apikale domenet vender mot bakterien, og BM-proteinene utskilles basalt 18,19. FCene skiller aktivt ut alle hovedkomponentene i BM, inkludert Collagen IV, Perlecan og Laminins20,21. I epitelceller som FCs produseres BM-komponentene og krever en spesialisert polarisert sekresjonsvei for deres avsetning ekstracellulært. For eksempel, når det gjelder den mest tallrike komponenten i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljene rundt polarisert intracellulær smugling og sekresjon vage til tross for at produksjonen og avsetningen er fokus for mange studier. Coll IV er oversatt i endoplasmic retikulum (ER), som også er der hver fibril - sammensatt av tre polypeptider (to α1 kjeder og en α2 kjede) - er samlet i en trippel helix22. Riktig Coll IV folding og funksjon krever ER anstander og enzymer, inkludert lysyl og prolyl-hydroksylaser som Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslasjonelle enzymene regulerer ER-sorteringen av Coll IV, da tapet av hver fører til at Coll IV blir fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Deretter avslutter nysyntetisert Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreseptoren Tango1 hjelper til med å pakke kollagener i betydelige Golgi-bundet vesicles som kan romme store multimeriske proteiner20,27. Når Coll IV er pakket inn i intracellulære eksokytiske vesicles, utskilles det spesielt basalt fra epitelceller. For å lede BM-avsetning til basalsiden krever epitelceller et annet sett med faktorer spesielt dedikert til polarisert BM-sekresjon. Ved hjelp av FE av Drosophila eggstokken, noen få komponenter i denne nye cellulære prosessen har blitt karakterisert, inkludert nukleotidutvekslingsfaktorene (GEFs) Crag og Stratum, GTPases Rab8 og Rab10, samt nivåene av fosfoinositide PI(4,5)P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponentene er avgjørende for å sikre polarisert fordeling av BM-proteiner.

For å overvåke intracellulær lokalisering av BM-proteiner i FE, kan endogene merkede kjellermembranproteiner (proteinfeller), som Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) brukes32,33. Disse proteinfellelinjene har vist seg å nøyaktig gjenspeile den endogene fordelingen av BM-proteiner og muliggjøre mer sensitiv deteksjon av bilikulærmenneskehandel 28,30. Komponentene som var involvert i polarisert avsetning av BM i FE ble først karakterisert ved hjelp av proteinfellelinjer for Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfeller kan brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutanter og Gal4-linjer 34. Videre kan proteinfeller brukes i kombinasjon med fluorescerende fargestoffer og / eller fluorescensimmunisering, noe som muliggjør presis karakterisering av lokalisering av BM-proteiner når man sammenligner villtype og mutantforhold35.

For å nøyaktig og effektivt vurdere distribusjon og lokalisering av BM proteinholdige vesikler, konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) og super-oppløsning bildebehandling teknikker utgjør en betydelig fordel for andre bildebehandling tilnærminger. Disse tilnærmingene kombinerer bildebehandling med høy oppløsning med relativt brukervennlighet. CLSM er en mikroskopiteknikk som muliggjør en forbedret optisk oppløsning ved å skanne prøven med en laser på en rasterskanning ved hjelp av galvanisometere. Pinhole blenderåpningen er en kjernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved å blokkere signalene som kommer ovenfra eller under brennplanet, resulterer pinhole-blenderåpningen i en svært overlegen oppløsning i z-aksen36. Dette gjør det også mulig å få en serie bilder i z-planet, kalt en z-stack, som tilsvarer en rekke optiske seksjoner. z-stabler lager deretter et 3D-bilde av prøven, via 3D-rekonstruksjon, ved hjelp av bildeprogramvare. Konvensjonelle epifluorescence (widefield) mikroskoper, i motsetning til konfektmikroskoper, gjør det mulig for lyset utenfor fokus å bidra til bildekvalitet, redusert bildeoppløsning og kontrast36,37. Dette gjør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat når man studerer proteinlokalisering eller colokalisering.

Selv om CLSM er en passende tilnærming for ulike bruksområder, inkludert avbildning og karakterisering av intracellulær smugling av BM-proteiner, presenterer den fortsatt et problem når man ser for seg prøver under Abbes diffraksjonsgrense for lys (200-250 nm). Ved avbildning av slike prøver kan konfektmikroskopi, spesielt når du bruker et oljemål, føre til høy oppløsning. Imidlertid overgår superoppløsningsteknikker grensen for konfektmikroskopi. Det finnes ulike tilnærminger for å oppnå mikroskopi med superoppløsning, hver med spesifikke oppløsningsgrenser, og hver egnet for ulike analyser. Disse tilnærmingene inkluderer fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), stimulert utslippsnedbrytningsmikroskopi (STED), strukturert belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superoppløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selv om Airyscan har en grovere oppløsning enn PALM/STORM, STED og SIM, kan den fortsatt oppnå en oppløsning på opptil ~ 120 nm (omtrent dobbelt så høy oppløsning som CLSM). Videre har denne mikroskopitilnærmingen med superoppløsning vist seg å ha en fordel i forhold til SIM og andre superoppløsningsteknikker når du ser på tykke prøver og prøver med et lavt signal-til-støy-forhold47,48.

Airyscan er en relativt ny superoppløselig konfokal mikroskopiteknologi46. I motsetning til tradisjonelle CLSMer, som bruker pinhole og enkeltpunktdetektorer for å avvise lyset utenfor fokus, bruker denne superoppløsningsmetoden en 32-kanals gallium arsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplier rørområdedetektor som samler alt lyset i hver skanneposisjon45. Hver av de 32 detektorene fungerer som et lite hull, noe som reduserer pinhole-størrelsen fra den tradisjonelle 1,0 Airy Unit (A.U.) til et forbedret 0,2 A.U., noe som muliggjør en enda høyere oppløsning og signal-til-støy-forhold, samtidig som effektiviteten til en diameter på 1,25 a.U.45 opprettholdes. Videre resulterer den lineære dekonvolusjonen som brukes av Airyscan i opptil en 2x økning i oppløsning45. Med tanke på dette er CLSM, og spesielt superoppløselig mikroskopi, godt egnet til å studere BM-proteiner og proteiner som regulerer basal avsetning av BM-proteiner, da de kan produsere svært høyoppløselige bilder for lokaliserings- og colokaliseringsstudier, og dermed gi ny innsikt i de romlige, tidsmessige og molekylære hendelsene som styrer disse prosessene.

En alternativ tilnærming til konfektmikroskopi som kan brukes til å utføre lokaliseringseksperimenter er bildedekonvolusjon. Siden widefield-mikroskopi gjør det mulig for lyset utenfor fokus å nå detektorene, kan matematiske og beregningsmessige dekonvolusjonsalgoritmer brukes til å fjerne eller tilordne lyset utenfor fokus fra bilder oppnådd ved widefield-mikroskopi, og dermed forbedre oppløsningen og kontrasten til bildet49. Dekonvolusjonsalgoritmer kan også brukes på konfiskeringsbilder for å øke oppløsningen og kontrasten ytterligere, og produsere endelige bilder som nesten kan sammenlignes med superoppløsningsmikroskopi50. Airyscan benytter seg av Weiner filterbasert dekonvolusjon sammen med Sheppards pikselomplassering, noe som resulterer i en svært forbedret romlig oppløsning og signal-til-støy-forhold. Sammenlignet med konfektmikroskopi observeres en økning på 2x i oppløsning i alle tre romlige dimensjoner (120 nm i x og y, og 350 nm i z) ved bruk av denne mikroskopiteknikken med superoppløsning45,51.

Dette manuskriptet gir detaljerte og optimaliserte protokoller for å flekke, anskaffe og visualisere intracellulær smugling og avsetning av BM-proteiner ved hjelp av FE av Drosophila-eggstokken som et modellsystem kombinert med konfokal og superoppløselig mikroskopi. Drosophila linjer som uttrykker endogene tagget kjeller membran proteiner, for eksempel Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøyaktige verktøy for å visualisere BM protein trafficking og sekresjon. I tillegg kan de enkelt brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutant og Gal4 / UAS linjer34. Selv om endogent merkede kjellermembranproteiner anbefales, er bruk av antistoffer mot spesifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokollene. Disse protokollene er spesielt nyttige for forskere som er interessert i å studere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i intakt epitelvev ved hjelp av konfomisk og superoppløselig avbildning. Videre gjør evnen til å kombinere epitelvevsanalyse med de ekspansive verktøyene til Drosophila genetikk denne tilnærmingen spesielt kraftig. Til slutt kan disse protokollene enkelt tilpasses for å studere bilhandel og sortering av andre proteiner av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Flyforberedelse for eggstokk disseksjoner

  1. Sett 10-15 Drosophila melanogaster kvinnelige fluer (1-2 dager gammel) av ønsket genotype i et smalt hetteglass som inneholder ~ 8 ml Drosophila fly medium sprinklet med en liten mengde granulert bakergjær 2-3 dager før disseksjon ved 25 °C. Å legge til noen menn til hetteglasset kan øke eggkammerutbyttet. Sørg imidlertid for at det totale antall fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke eggstokkutviklingen negativt.
    MERK: Beskrivelse av Drosophila menn og kvinner, og nyttige tips og råd for forskere uten tidligere Drosophila erfaring finnes i de siterte artiklene34,52. Å legge til gjær vil stimulere eggproduksjonen og generere eggstokkene med forskjellige stadier representert. Videre vil det også fett eggstokkene og gjøre dem lettere å utskille. Våt gjær kan også brukes i stedet for granulert gjær, men for svakere bestander kan fluene bli sittende fast og dø.

2. Eggstokkavhandling og fiksering

MERK: For ytterligere ressurser på eggstokk disseksjon og farging, leserne er rettet til de siterte protokollene 53,54,55.

  1. På disseksjonsdagen, lag fersk fikseringsløsning med en endelig konsentrasjon på 4% paraformaldehyd (PFA) ved å fortynne PFA-lagerløsningen i 1x fosfatbuffer saltvann (PBS).
  2. Bedøv fluene ved hjelp av CO2 og legg dem på en flypute. Hold fluene bedøvet til disseksjon. Vurder fluer riktig bedøvet når bevegelsene deres har opphørt, noe som vanligvis tar 10-20 s.
    MERK: Selv om bruk av CO2 anbefales som et tryggere og raskere alternativ, kan fluer bedøves ved hjelp av is.
  3. Plasser en glasskonkav glide- eller fargingsfat med grunne depresjonsbrønner under et dissekerende mikroskop og fyll brønnene med 1x PBS.
  4. Ta tak i en kvinnelig fly på den nedre thoraxen ved hjelp av et par tang. Forsikre deg om fluenes kjønn ved fravær av mannlige kjønnsorganer i den bakre enden av magen og fraværet av sexkammer på forbenene som sekundærkarakteristikk52. Dissekerer fluer individuelt ved hjelp av et annet par tang (trinn 2.5) mens de senkes ned i brønner fylt med 1x PBS under dissekeringsmikroskopet (20x forstørrelse anbefales).
  5. Mens du ser gjennom dissekeringsmikroskopet, bruk et annet par tang for å slepe på den bakre delen av flylivet, noe som gjør de indre organene (f.eks. eggstokkene, tarmen) synlige.
  6. Klem forsiktig den fremre delen av flylivet (som med et rør med tannkrem) for å tvinge eggstokkene ut av magen. Denne metoden bør holde eggstokkene intakte. Løsne og fjern forsiktig andre organer og fly rusk.
  7. Bruk tang eller dissekering nåler, skille eggstokkene i eggstokken mens du holder den generelle eggstokkstrukturen intakt. Hensikten med dette trinnet er å bryte muskelhylsen som dekker eggstokkene og gi mulighet for en mer effektiv og homogen farging.
  8. Overfør eggstokkene raskt til et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 1x PBS og hold røret på is til alle fluene er dissekert. Ikke hold røret på is hvis mikrotubuler eller mikrofilamenter (eller vesikler trafikkert av disse cytoskeletale komponentene) skal visualiseres, da dette kan forårsake depolymerisering.
  9. Når alle eggstokkene er dissekert og overført til et mikrosenterrør, la dem synke til bunnen av røret og fjerne alle unntatt ~ 50 μL av PBS. Tilsett 1 ml 4% PFA og legg på en nøtteplattform rocker i 15 min. Viktigst, sjekk om eggstokkene beveger seg frem og tilbake i fikseringsløsningen for å tillate riktig fiksering, da ufullstendig fiksering kan føre til farging og bildebehandlingsproblemer.
    MERK: Mutterens hastighet er ikke avgjørende. Mens noen muttere har en hastighetskontroll, kommer andre med en forhåndsinnstilt hastighet. Den forhåndsinnstilte hastigheten er tilstrekkelig, og hvis den er justerbar, sett til 40-50 rpm.
  10. Fjern fikseringsløsningen (som i trinn 2.9), og utfør deretter to hurtigvasker med 1 ml 1x PBS som inneholder 0,1% Triton-X 100 (1x PBST), ved å forsiktig invertere mikrofugerørene 5-6 ganger. Fortsett deretter med fire 10-15 min vasker (lang vask) med 1 ml 1x PBST (40-60 min totalt).
    MERK: Det anbefales å bruke 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 for vasker, da økning av prosentandelen vaskemiddel kan føre til GFP-denaturering, noe som fører til redusert fluorescens og påvisning av GFP-merkede BM-proteiner.
  11. For fargestofffarging, for eksempel DNA- og F-aktinfarging, fortsett til trinn 3. For immunstaining, fortsett til trinn 4. Eggstokkene kan oppbevares i 1x PBST ved 4 °C i opptil 24 timer før du fortsetter.

3. Standard DNA / F-Actin farging

  1. Etter fiksering og vasking, fjern PBST. Tilsett 500 μL DNA og F-Actin fargingsløsning. For å klargjøre DNA/F-Actin-løsningen, bland Hoechst (DNA-flekk; 1:1000 fortynning av 1 mg / ml lageroppløsning) og fluorofortegnet falloidin (F-aktinflekk; 1:500 fortynning for Alexa Fluor 546 eller 1:100 fortynning for Alexa Fluor 647, hver av 66 μM lageroppløsning) i 500 μL PBST.
  2. Dekk rørene med aluminiumsfolie for å holde eggstokkene og fargestoffene i mørket for å opprettholde fluorescensen for effektiv avbildning og inkubere på en nøtteplattform rocker i 15 minutter.
  3. Etter inkubasjon fjerner du DNA/F-Actin-løsningen (som i trinn 2.9). Utfør to hurtigvasker og tre lange (10-15 min) vasker i 1x PBST som beskrevet i trinn 2.10. Fortsett til monteringen som beskrevet i trinn 5.

4. Fluorescensimmunisering

MERK: Dette er en standard immundempende protokoll for fluorescerende avbildning og er kompatibel med de fleste primære antistoffer.

  1. Blokkering og primær antistoffimmunisering (dag 1)
    1. Etter fiksering og vasking, fjern PBST som beskrevet i trinn 2.9. Tilsett 1 ml blokkeringsløsning (PBS + 5% BSA) og blokker eggstokkene på en muteringsplattform rocker i 1 t minimum.
      MERK: I tillegg til BSA kan foster bovint serum (FBS) eller normalt geiteserum (NGS) legges til blokkeringsløsningen. Alternativt kan eggstokkene blokkeres over natten på en nøtteplattform rocker ved 4 °C.
    2. Fjern blokkeringsløsningen som i trinn 2.9 og tilsett 300 μL primær antistoffløsning som inneholder primære antistoffer fortynnet ved deres passende konsentrasjoner (spesifikk for antistoffet som brukes) i blokkeringsløsningen. Inkuber over natten på en nøtteplattform rocker ved 4 °C. Neste dag, fjern den primære antistoffløsningen og fortsett til sekundær antistoffimmunisering.
      MERK: Noen primære antistoffer kan lagres og brukes på nytt. I noen tilfeller kan gjenbrukte primære antistoffer redusere bakgrunnsfarging, noe som resulterer i bedre avbildning. Gjenbruk bør imidlertid testes for hvert antistoff for å sikre effektivitet.
  2. Sekundær antistoffimmunisering (dag 2)
    1. Etter å ha fjernet den primære antistoffløsningen, utfør to raske vasker og fire lange (10-15 min) vasker som i trinn 2.10. Nøye utførte repeterende vasker ved hjelp av frisk 1x PBST vil redusere ikke-spesifikk bakgrunn og føre til optimal avbildning.
    2. Fjern PBST som i trinn 2.9 og tilsett 500 μL sekundær antistoffløsning som inneholder fluorescerende sekundære antistoffer som vil oppdage de primære antistoffene som brukes. Beskytt røret mot lys ved å dekke det i aluminiumsfolie fra dette tidspunktet for optimal bevaring av fluorescens, noe som er kritisk for bildeanskaffelse og analyse.
      MERK: Den sekundære antistoffløsningen skal inneholde sekundære antistoffer konjugert med fluoroforer som ikke overlapper med endogene kodede proteiner. Hvis du for eksempel bruker GFP-taggede proteiner, anbefales bruk av Sekundære Alexa Fluor-antistoffer ved røde eller fjernrøde bølgelengder (f.eks. 546, 568 eller 647 nm). Fluorescerende fargestoffer, som Hoechst og Alexa Fluor 546 eller 647 konjugert falloidin, kan legges til sekundærløsningen. Disse flekkene kan være nyttige for å markere den generelle cellestrukturen (dvs. kjerner og F-Actin). Se trinn 3.1 for konsentrasjonene.
    3. Inkuber eggstokkene i den sekundære antistoffløsningen på en muteringsplattform rocker i 2 timer ved romtemperatur. Utfør to hurtigvasker og fire lange (10-15 min) vasker i 1x PBST som i trinn 2.10. Fortsett til monteringen som i trinn 5.

5. Montering av fargede eggstokkene

MERK: Denne metoden fungerer veldig bra hvis eggstokkene er godt utviklet og rikelig. Forsiktig montering av eggstokkene på lysbildet er avgjørende for optimal avbildning.

  1. Etter siste vask, bruk en p1000 pipette for å forsiktig røre eggstokkene opp og ned i røret for å skille eggkamrene. La eggkamrene synke til bunnen ved å holde røret i oppreist stilling i 5-10 min. Forsiktig separasjon av individuelle eggkamre er avgjørende for å oppnå optimal bildeoppkjøp.
  2. Fjern PBST ved hjelp av en Pasteur-pipet, og la ~50 μL. Fjern så mye av den gjenværende PBST som mulig ved hjelp av en p200 pipette. Tilsett to dråper monteringsmedium, nok til å spre seg jevnt på en 22 mm x 22 mm dekslerlip. Eggstokkene kan oppbevares i monteringsmedium i mikrosenterrør ved 4 °C i opptil 1 måned før montering.
    MERK: Flere forskjellige monteringsmedier er tilgjengelige kommersielt; Bruk av hardinnstillingsfestemidler, for eksempel Aqua-Poly/Mount eller ProLong Glass Antifade Mountant, anbefales for å oppnå optimale bildeforhold. Bruken av glyserol som monteringsmedium frarådes siden det kan føre til dårlige bildeforhold (f.eks. ustabilitet i fluorofor). For monteringsmedier som ikke polymeriseres, forsegler du dekslene med et deksleslipforseglingsmiddel / neglelakk for å feste det på plass.
  3. Merk en glasssklie og tørk den med mykt, støvfritt papir for å fjerne støv og fingeravtrykk. Klipp av enden av en p200 pipettespiss for enkel overføring av det viskøse monteringsmediet til sklien fra mikrocentrifugerøret. Deretter overfører du sakte alle eggkamrene i monteringsmediet til glasssklie, og sikrer ikke å lage bobler.
  4. Under et dissekerende mikroskop sprer du forsiktig ut monteringsmediet og separerte eggkamrene ved hjelp av en ny p200-spiss eller tang for å dekke et område omtrent på størrelse med dekslene.
  5. Bruk tang, plasser forsiktig dekslene (rengjort med støvfritt papir) på eggkamrene i en vinkel for å unngå bobler.
  6. Oppbevar gliden ved romtemperatur på en flat overflate i mørket i 2 dager for å polymerisere. Når monteringsmediet er herdet, kan lysbildet lagres ved 4 °C i mørket i noen uker for avbildning.
    MERK: Det er viktig at monteringsmedium med hard innstilling polymeriseres før avbildning. Hvis mediet ennå ikke har polymerisert, vil eggstokkene flyte under dekslene, noe som påvirker bildeanskaffelsen. Videre oppnås den optimale reflekterende indeksen for monteringsmedier først etter at den er fullstendig angitt (se produsentens informasjon for detaljer).
  7. Alternativ monteringsmetode: Denne metoden anbefales å redusere vevstap hvis eggstokkene ikke er rikelig. I denne metoden (beskrevet nedenfor) skiller du eggariolene og eggkamrene på lysbildet under montering, i stedet for å skille dem i et mikrocentrifugerør ved pipettering som beskrevet i trinn 5.1.
    1. Etter den siste vasken, fjern alle unntatt ~ 100 μL av vaskeoppløsningen. Bruk en Pasteur pipette eller p1000 pipette, overfør de intakte eggstokkene i PBS til lysbildet. Bruk en p200 pipette og fjern forsiktig så mye PBST fra lysbildet som mulig. Bruk eventuelt støvfritt papir til å tørke bort PBST. Ikke rør eggstokkene.
    2. Tilsett to dråper monteringsmedier. Separer forsiktig eggariolene og eggkamrene ved hjelp av tang eller dissekerende nåler. Fjern og kast fremmedvev, og spred deretter ut eggkamrene og eggariolene i monteringsmediet. Fortsett til trinn 5.5-5.6.

6. Confocal bildeoppkjøp

MERK: Denne delen inneholder nøkkelparametere for å oppnå optimal bildeanskaffelse ved hjelp av et hvilket som helst konfokalt mikroskop (figur 2).

  1. Sett opp mikroskopet og finn prøven som beskrevet nedenfor.
    1. Før avbildning er det avgjørende å lokalisere interesseområdet (ROI) ved hjelp av okularet til fluorescensmikroskopet. Bruk et mål for lav forstørrelse (20x) eller målet som skal brukes til bildeanskaffelse (dvs. 40x eller 63x). Velg et eggkammer som skal avbildes.
      MERK: For bildeanskaffelse anbefales det å bruke høye forstørrelsesmål som 40x eller 63x (se 6.2.1).
    2. Når avkastningen er valgt, fortsett til bildeanskaffelse; Fortsett til trinn 6.2 for konføderering, og trinn 7 for bildebehandling med superoppløsning.
  2. Velg nøkkelparameterne for optimal bildeanskaffelse som beskrevet nedenfor (eksempler på nøkkelparametere for de representative bildene er angitt i tabell 1).
    1. Velge et mål: For konfokal bildeanskaffelse av intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i FE, bruk et mål på 40x eller 63x.
      MERK: For å oppnå best mulig oppløsning anbefales det på det sterkeste å bruke Plan-Apochromat-mål, med høy numerisk blenderåpning (NA) som gir høyest akromatisk korreksjon.
    2. Velge lasere for hver kanal/spor: For GFP, bruk laser 488 nm; for DAPI eller Hoechst, bruk laser 405 nm; for Alexa Fluor 546 eller 568, bruk laser 561 nm; og for Alexa Fluor 647, bruk laser 640 nm.
      MERK: Hvert laservalg vil resultere i en annen kanal/sporformasjon. Her refererer begrepet kanal til bildet dannet av den registrerte intensitetsfordelingen for begeistrede fluoroforer for den valgte avkastningen ved den spesifikke bølgelengden til hver kanal.
    3. Pinhole-innstilling: For å redusere lyset utenfor fokus under bildeanskaffelse, sett hullhullet for hver kanal til 1 AU.
    4. Innstillinger for laserintensitet og detektorforsterkning: For å finjustere bildefølsomheten, bruk både detektorens master gain og laserkraft. En områdeindikator anbefales for å angi bildefølsomheten riktig. Still inn både master gain og laserkraft for å ha en riktig følsomhet der strukturene av interesse (f.eks. BM-inneholdende vesikler) er tydelig synlige samtidig som detektormetningen unngås.
      MERK: For å unngå fotobleking, bruk den minimale laserkraften som er nødvendig. Det anbefales å øke detektorforsterkningen først mens du bruker lavest mulig lasereffekt. Hvis en økning av detektorforsterkningen ikke oppnår ønsket intensitet, øker du laserkraften. Lasereffektintensitet mellom 0,5% -1,2% anbefales.
    5. Rammestørrelse: Det anbefales å bruke den optimale bildestørrelsen som bestemmes av oppkjøpsprogramvaren. For de fleste programmer bruker du en maksimal oppløsning på 1024 x 1024. Høyere oppløsning vil øke oppkjøpstiden betydelig.
    6. Skannehastighet: Bruk en skannehastighet mellom 6-9, som er trygg for de fleste prøver. Hvis prøven er støyende, bruker du en lavere skannehastighet for å forbedre signal-til-støy-forhold. Lave skannehastigheter øker imidlertid fotobleaching- og oppkjøpstiden.
    7. Gjennomsnittlig intensitetsgjennomsnitt: For å forbedre bildekvaliteten, bruk gjennomsnittlig intensitetsgjennomsnitt via påfølgende skanninger med identiske innstillinger. I de fleste tilfeller bruker du et gjennomsnitt på to for å forbedre signal-til-støy-forhold uten å fotobleaching prøven.
    8. Zoom: Juster skanneområdet ved hjelp av zoomfunksjonen. Bruk en zoom mellom 2x-4x med både 40x og 63x mål som den mest effektive verdien for å tydelig visualisere BM-inneholdende vesicles i FE. Velg nøye den minimale avkastningen for å redusere anskaffelsestiden.
  3. Hvis du vil anskaffe en z-stack ved hjelp av Zeiss Zen-programvare, bruker du følgende Z-seksjoneringsparametere og angir dem som beskrevet nedenfor.
    MERK: Vesicles og andre intracellulære strukturer som inneholder BM-proteiner er 3-dimensjonale (3D) strukturer. Å anskaffe en z-stack gjennom FE vil forbedre bildekvaliteten og oppløsningen betydelig. Vanligvis er et område som spenner over tykkelsen / dybden på vevet tilstrekkelig til effektivt å visualisere intracellulær lokalisering. For optimal 3D-rekonstruksjon anbefales det å bruke det optimale intervallet som bestemmes av programvaren. For mål på 40x og 63x unngå intervaller som er høyere enn 0,5 μm mellom hver z-seksjon for å muliggjøre optimal 3D-rekonstruksjon.
    1. Klikk på z-Stack-avkrysningsruten i hovedområdet under Kategorien Anskaffelse . Velg skannemodusen Alle spor per stykke for z-stakken. Dette vil resultere i en endring i kanalspor for hvert z-posisjonsstykke.
    2. Velg ønsket kanal for å observere prøven og klikk på Live for å starte en live scan. Bruk av kanalen som trengs for å oppdage GFP-merket BM-protein anbefales.
    3. Angi et område for z-stakken som beskrevet. Bruk finjusteringsknappen på mikroskopet, finn z-plasseringen for den ene enden av prøven, og klikk på Sett først. På samme måte finner du z-plasseringen for den andre enden av prøven og klikker på Angi sist.
    4. For hvert sted i z-stabelen klikker du hver kanal separat med områdeindikatoren valgt, og justerer intensiteten til laseren og masterforsterkningen etter behov, som beskrevet i trinn 6.2.4.
    5. Angi intervallet for z-stakken for å tilordne trinnstørrelsen som anbefalt i merknaden nedenfor trinn 6.3. Klikk på Start eksperiment for å starte z-stack-oppkjøpet.

7. Bildeanskaffelse med superoppløsning

  1. Velg en Airyscan-kompatibel målsetting. For å visualisere den intracellulære lokaliseringen av BM-protein, er bruk av et 63x oljemål optimalt (figur 3). Sett målet til 63x og legg forsiktig en dråpe nedsenkningsolje på linsen. Plasser lysbildet på målet med deksler som vender mot målet om å finne prøven.
  2. Velg en konfigurasjon med passende innstillinger for fluoroforen til bildet som beskrevet nedenfor.
    1. Klikk smartoppsettknappen i kategorien Anskaffelse for å konfigurere et nytt eksperiment. Velg Airyscan (superoppløsning); Når dette er valgt, kreves det et ytterligere valg mellom Oppløsning (Airyscan SR), SNR/sensitivitet (Airyscan Confocal) og Speed (Multiplex SR-2Y). For fast vev velger du Oppløsning som det vil resultere i det beste oppkjøpet.
    2. Klikk på + i Konfigurer eksperimentboksen for å legge til spor/kanaler. Velg sporene for bestemte fargestoffer fra Dye Database. For et flerkanalseksperiment legger du til hvert spor etter behov ved å velge de aktuelle fargestoffene.
    3. Når alle sporene er lagt til, velger du et av eksperimentforslagene fra programvaren. For dette eksperimentet, bruk Best Signal, som om hastigheten vil være litt tregere sammenlignet med Smartest (Line) forslaget, vil det skape de beste maskinvareinnstillingene for hvert fargestoff, noe som resulterer i maksimal signalforsterkning og minimal utslipp krysstale. Når eksperimentet er angitt og lastet inn, vises det i Imaging Setup-vinduet i kategorien Anskaffelse.
    4. Når et smart oppsett er valgt, velges rekkevidden av bølgelengder for detektoren GaAsP-PMT automatisk. Juster området ved å flytte rullefeltet nederst for å øke eller redusere området eller flytte området helt til et annet område etter behov. Bruk denne til å sikre at områdene i to forskjellige kanaler ikke overlapper hverandre for å unngå krysstale. Lagre konfigurasjonen for gjenbruk i fremtiden.
  3. Når konfigurasjonen er angitt, fortsetter du med å justere zoom- og skanneområdet som i trinn 6.2.8. Optimaliser skanneområdet for å fokusere på interesseområdet for å redusere skannetid og lagringsplass. Fortsett med å hente bilder.
  4. For hver enkelt kanal velger du et spor under Kanal og klikker på Live. Juster hovedforsterkningen og laserkraften ved hjelp av områdeindikatorverktøyet som beskrevet i trinn 6.2.4, og følg alle retningslinjene som er beskrevet for å unngå mettede bildepunkter. Kontroller at sekskantet detektorvisning er sentrert og justert ved å klikke på Airyscan Detector View-knappen . I de fleste tilfeller midtstilles og justeres sekskantet detektorvisning automatisk. Gjenta for flere kanaler.
  5. I vekslevinduet for anskaffelsesmodus, under Bildestørrelse, klikker du på SR (superoppløsningsbegrenset pikselantall) for å maksimere detektorens evner. Dette justerer rammestørrelsen automatisk.
  6. Hold gjennomsnittet til Ingen , da det vanligvis ikke er nødvendig, og dette vil redusere skannetiden. I noen tilfeller kan et gjennomsnitt på 2x forbedre signal-til-støy-forholdet.
  7. Samle inn rådata med 8-biters datadybder. Klikk på Snap for å skaffe deg et bilde. Hvis du vil anskaffe en z-stakk, følger du trinn 6.3.
  8. Utfør bildebehandling som beskrevet nedenfor. Dette vil gi et 16-biters bilde.
    1. Når bildet eller z-stakken er oppnådd, klikker du på Prosessering >-metoden og velger Airyscan Processing.
    2. Utfør automatisk filter til å begynne med og utføre ytterligere manuell behandling ved å endre SR-verdien for å oppnå de beste resultatene for prøven. Når den optimale SR-verdien er bestemt, klikker du på Bruk for å generere et behandlet bilde. Når det gjelder z-stack-bilder, må du behandle enten som én z-sektor (Gjeldende bilde [2D]) eller som hele z-stakken ved å klikke på 3D-behandlingsboksen .

8. Bildebehandling og dataanalyse (ortogonal projeksjon, 3D-rekonstruksjon og intensitetsprofil)

MERK: For denne metoden er trinnene som brukes til å generere ortogonale projeksjoner, 3D-rekonstruksjoner og intensitetsprofiler beskrevet for Zen-programvaren (se Materialfortegnelse). Lignende dataanalyser kan også utføres med ImageJ software56.

  1. Utfør ortogonal projeksjon som beskrevet nedenfor (figur 4).
    1. Når en z-stabel er oppnådd ved hjelp av konfokal mikroskopi eller superoppløsningsmikroskopi, genererer du en ortogonal projeksjon for å vise vesiklene i z-aksen i cellen i en 2D-visning (sammenlignet med 3D-rekonstruksjon). For å gjøre dette, klikk på Processing > Method og velg Orthogonal Projection.
    2. Velg projeksjonsplanet som kreves, under parametere. Hvis du vil ha en projeksjon av z-aksen (z-stack), velger du Frontal -planet (XY). Velg Maksimum under Metode for å resultere i projeksjon av høyeste kvalitet.
    3. Deretter bestemmer du tykkelsen på projeksjonen ved å velge startposisjonen (start z-stykke), og bestemme tykkelsen (totalt antall z-stykker) i projeksjonen. Det er ideelt å velge tykkelsen som er lik tykkelsen på en celle i z-aksen.
    4. Når parametrene er satt, klikker du på Bruk for å opprette projeksjonen av z-stabelen på en XY-plan måte.
      MERK: Når du oppretter ortogonale projeksjoner av flere z-stabler for å sammenligne mengden av et bestemt objekt av interesse, er det viktig å holde tykkelsen på projeksjonen den samme (eller så nært som mulig) for datanøyaktighet.
  2. Utfør 3D-rekonstruksjon som beskrevet nedenfor (figur 5).
    1. Lag 3D-rekonstruksjoner av z-stabler for å observere lokalisering og form av strukturer. Gjør dette for z-stabler som er anskaffet ved hjelp av konfomiske tilnærminger og superoppløsningsmetoder. Behandle z-stabler med superoppløsning først ved hjelp av 3D-behandling som i trinn 7.8 for 3D-rekonstruksjon.
    2. For å generere et 3D-bilde, klikk på 3D-ikonet i forhåndsvisningsvinduet. Når du har klikket, vises en 3D-fane i skjermkontrolldelen nederst på skjermen. 3D-visninger, for eksempel Gjennomsiktighet, Volum, Maksimum, Overflate og Blandet, vil være synlige. Bruk Surface- eller Mixed-visninger når du viser strukturen til vesicles (kan foretrekkes).
    3. For bilde av høyeste kvalitet velger du Nøyaktig-innstillingen , siden den raskeste innstillingen vil være mindre nøyaktig og føre til dårlig 3D-gjengivelse.
    4. Når bildet er generert, manipulerer du det ved å rotere og zoome for å fokusere på et foretrukket sted for å vise objektene av interesse. Manipulere 3D-bildet under Kategorien Utseende .
    5. Når en tilfredsstillende visning er oppnådd, velger du Vist oppløsning under 3D-fanen, og deretter klikker du Opprett bilde. Dette vil opprette et øyeblikksbilde av bildet i samme retning som det ble vist og kan lagres og eksporteres i forskjellige filformater.
  3. Generer en intensitetsprofil som beskrevet nedenfor (figur 7).
    MERK: Fordelings- og intensitetsprofilene til pikslene som er knyttet til de forskjellige fluorescerende signalene, kan ses på som et overleggsbilde for å bestemme colokaliseringen.
    1. Når et optimalt bilde er anskaffet via konfikal eller superoppløsningsavbildning, klikker du på Profil i Visning-panelet i forhåndsvisningsvinduet. I forhåndsvisningsvinduet vises et histogram som viser intensitetsprofilen som en funksjon av avstand, i tillegg til en tabell som viser avstander og intensitetsverdier.
    2. I området for visningskontroll nederst på skjermen klikker du pilverktøyet i kategorien Profildefinisjon . Tegn en pil langs lengden på objektet som intensitetsprofilen for de ulike bildepunktene må vurderes for. Hvis du vil tegne pilen, zoomer du inn på bildet.
    3. Intensitetsprofilen vises til venstre for forhåndsvisningen av bildet, der avstanden og de tilsvarende toppene langs banen til pilen vises. Hvis du vil fjerne histogrammet som vises på selve bildet, fjerner du merket for Vis profil i grafikk .
    4. I kategorien Dimensjoner i skjermkontrollområdet fjerner du merket for kanaler som ikke skal inkluderes i intensitetsprofilen.
    5. I kategorien Grafikk dobbeltklikker du på Profil som vises under Boksen Merknader/mål for å åpne popup-boksen Formater grafiske elementer . Bruk denne til å endre fargen på pilen i tillegg til stilen og strektykkelsen. Lukk boksen etter at du har valgt de ønskede innstillingene.
    6. Klikk kategorien Profilvisning . I den nye bildedelen klikker du på Gjeldende visning og deretter på Lagre som for å lagre filen. Det anbefales å lagre filen som en .tif fil for å unngå komprimering og tap av data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metodene beskrevet heri kan brukes til å effektivt og nøyaktig bilde og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i polariserte epitelceller, for eksempel FE av Drosophila eggstokken. Deretter gir vi forventede resultater oppnådd ved hjelp av de beskrevne metodene, samt nyttige råd og potensielle fallgruver. For å gjøre dette brukes Vkg-GFP, en endogenet merket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultatene oppnås med andre endogene taggede BM-proteiner som Pcan-GFP.

Angi optimale anskaffelsesparametere (figur 2)
For å nøyaktig karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner, som Vkg og Pcan, i epitelceller, er det viktig å sette oppkjøpsparametrene til det konfiske mikroskopet riktig som beskrevet i de gitte metodene.

Ved hjelp av konfokal mikroskopi kan den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP oppdages før den utskilles og avsettes basalt i FE (figur 2A). Det har vist seg at etter oversettelse i ER, Blir Coll IV transportert til Golgi før den pakkes inn i intracellulære eksokytiske vesikler. Ved hjelp av denne bildemetoden observerer vi at Vkg-GFP akkumuleres i intracellulære rom med forskjellige former, som potensielt representerer forskjellige organeller, eneosomale rom og vesicletyper (figur 2A, piler). I eksocytiske vesikler er Coll IV allerede samlet i fibrils sammensatt av tre polypeptider: to α1-kjeder og en α2-kjede (Vkg i Drosophila), noe som fører til dannelsen av strakte vesikler som også kan visualiseres ved hjelp av konfokal avbildning (figur 2A, piler). Deretter utskilles Coll IV spesielt basally fra epitelceller der den deponeres i BM (figur 2, pilspisser).

Hvis anskaffelsesparametrene ikke er riktig innstilt, er det ikke mulig å nøyaktig observere de forskjellige morfologiene og posisjonene under intracellulær smugling av BM-proteiner (figur 2B, C). Hvis for eksempel anskaffelsesparametrene er optimalisert for å visualisere den ekstracellulære BM-en og ikke intracellulære strukturene, vises BM-proteinholdige endosomale rom og vesikler (her merket med Vkg-GFP) svake eller ikke synlige (figur 2B). Motsatt, hvis detektorene er altfor mettet, kan den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP påvises som i optimal tilstand (sammenlign figur 2A og figur 2C), men en økning i bakgrunnsfluorescensstøy gjør tolkningen av BM-proteinlokaliseringen vanskeligere, spesielt for colokaliseringsforsøk (se figur 7 ). Samlet sett illustrerer disse dataene viktigheten av riktige anskaffelsesparametere for å oppnå nøyaktig lokalisering av BM-proteiner i epitelet.

Angi optimale parametere for superoppløsning og dekonvolusjon (figur 3)
Som illustrert for konfomisk bildeanskaffelse, er det også viktig å angi anskaffelsesparametrene riktig ved bruk av superoppløsningsmikroskopi for å unngå under- eller overmetning. Denne avbildningsmetoden med superoppløsning innebærer også nøye konfigurasjon av dekonvolusjonsparametere for å oppnå bildebehandling med superoppløsning (figur 3). Når dekonvolusjonsbehandling er optimalt konfigurert, øker superoppløsningsavbildningen signifikant oppløsningen av intracellulære strukturer som inneholder BM-proteiner (figur 3A, piler), for eksempel vesicles- eller Golgi-strukturer (figur 3A og figur 7C), selve BM-en (figur 3A, pilspisser), og forbedrer signal-til-støy-forholdet45 . Super-oppløsning mikroskopi fører til en ~ 2x økning i oppløsning i alle tre romlige dimensjoner sammenlignet med konfokal mikroskopi. Denne økningen i oppløsningen er tydelig illustrert av de bedre definerte bildene av intracellulær smugling av BM-proteiner og BM tatt ved hjelp av superoppløsningsavbildning sammenlignet med de som er tatt med standard CSLM (sammenlign figur 2A og figur 3A).

Hvis dekonvolusjonsparametere ikke er riktig angitt, oppnås ikke superoppløsningen optimalt, og økningen i oppløsningen går tapt. Underbehandling av bilder med superoppløsning fører til uskarpe bilder, noe som resulterer i at intracellulær lokalisering av BM-proteiner ser svake ut og ikke så godt definert som under optimale forhold (sammenlign figur 3B med figur 3A). Omvendt fører overbehandling av bildene til kornete bilder, der den intracellulære lokaliseringen av BM-proteiner vises pikselert (figur 3C). Disse dataene fremhever viktigheten av å bruke riktige dekonvolusjonsparametere for å oppnå meningsfulle og representative bilder som gjenspeiler den intracellulære fordelingen av BM-proteiner.

Til sammen viser og fremhever disse dataene tydelig den forbedrede oppløsningen av intracellulær smugling av BM-proteiner ved hjelp av bildebehandling med superoppløsning sammenlignet med konfomisk mikroskopi. Spesielt gir denne tilnærmingen bedre visualisering av intracellulær smugling av BM-proteiner ved å forbedre oppløsningen av de intracellulære strukturene som er involvert. Dette gjør at sammenligningen av forskjellige størrelser og former av strukturer bedre kan identifisere og karakterisere nye faktorer som er involvert i polarisert avsetning av BM-proteiner i FE.

Ortogonal projeksjon og 3D-rekonstruksjon av optiske z-seksjoner (z-stack) gjennom FE for å forbedre visualiseringen av den intracellulære fordelingen av BM-proteiner (figur 4 og figur 5)
Siden den intracellulære fordelingen av BM-proteiner er til stede gjennom FE i 3D (x-, y- og z-akser), kan ortogonal projeksjon og/eller 3D-rekonstruksjon av optiske z-seksjoner gjennom FE, enten ved hjelp av superoppløsning eller konfokal mikroskopi, brukes til å vurdere lokaliseringen og fordelingen av BM-proteiner i villtype- eller mutantceller (f.eks. i figur 4).

Ortogonal projeksjon gjør det mulig å projisere alle z-seksjonene som er anskaffet i et enkelt plan. Denne metoden er spesielt nyttig for å vise den totale fordelingen av vesicles og rom som inneholder BM-proteiner i et enkelt bilde ved hjelp av konfokal (figur 4A) eller superoppløsning (figur 4B) avbildning. Et betydelig bedre oppløsnings- og mindre bakgrunnsstøyresultat ved bruk av mikroskopi med superoppløsning enn konfokal mikroskopi (sammenlign figur 4B og figur 4A).

En annen tilnærming for å visualisere den totale fordelingen av BM-inneholdende rom og vesikler er å generere en 3D-rekonstruksjon ved å sette sammen en stabel med optiske z-seksjoner tatt av konfokal (figur 5A) eller superoppløsning (figur 5B) bildebehandling. Denne tilnærmingen kan også være svært effektiv for å vurdere lokalisering og distribusjon av intracellulære BM-proteiner og formen på rom og vesikler som inneholder Vkg-GFP, spesielt ved bruk av superoppløsningsmikroskopi (figur 5). Tradisjonell konfektmikroskopi (figur 5A) resulterer i høyere bakgrunnsstøy sammenlignet med superoppløsning (figur 5B), som ved regnskap i 3D-gjengivelse kan føre til artefakter. Videre resulterer den lavere oppløsningen av konfokal også i bildene som er opprettet, mindre glatte og definerte enn de som genereres av superoppløsning (sammenlign figur 5A og figur 5B).

Karakterisering av fenotypene forbundet med tap av komponenter involvert i polarisert sekresjon av BM-proteiner ved bruk av superoppløsningsavbildning (figur 6)
Som vist så langt (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5), kan mikroskopi- og bildebehandling med superoppløsning brukes til å vurdere intracellulær lokalisering og distribusjon av BM-proteiner i wildtype FE av Drosophila-eggstokken . Videre kan denne tilnærmingen også brukes til å bestemme og sammenligne lokalisering av BM-proteiner i mutant- eller knockdown-forhold. Dette er dermed en effektiv metode for å karakterisere rollen(e) til nylig identifiserte komponenter dedikert til polarisert intracellulær smugling, sekresjon og avsetning av BM-proteiner.

GTPase exchange factor (GEF) Crag har vist seg å være en nøkkelkomponent i en biologisk vei dedikert til polarisert avsetning av BM-proteiner28. I Crag knockdown FCs akkumuleres BM-proteiner både apically og basally, noe som indikerer at Crag kontrollerer polarisert sekresjon av BM-proteiner som Vkg-GFP (figur 6). Bruken av superoppløselig mikroskopi gir bedre karakterisering av fenotypen som følge av tap av Crag. For eksempel observeres en sterk apikal akkumulering av BM-proteiner, samt organiseringen av ektopisk apikal BM, i Crag-knockdown FCs (figur 6B, pilspisser). Videre, når fenotypen er mindre avvikende, oppdages BM-membran som akkumuleres apisk i små flekker i FCs (figur 6B, piler). Til sammen illustrerer disse dataene at mikroskopi med superoppløsning kan brukes til å karakterisere mutantfenotyper for bedre å forstå rollene til komponenter som er involvert i polarisert avsetning av BM.

Colokaliseringseksperiment ved hjelp av antistoffer og endogene taggede BM-proteiner avbildet ved hjelp av konfikal mikroskopi med superoppløsning (figur 7)
Til slutt kan bruk av antistoffer mot spesifikke intracellulære markører eller nylig identifiserte komponenter kombinert med endogene taggede BM-proteiner brukes til bedre å karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i det polariserte epitelet. GM-130, en cis-Golgi-markør, brukes til å illustrere dette punktet. Før han pakkes i sekresjons vesikler, blir Coll IV transportert til Golgi. Når den subcellulære fordelingen av Vkg-GFP vurderes ved hjelp av konfekt (figur 7A,B) eller superoppløsning (figur 7C,D) bildebehandling, viser begge tilnærmingene at Vkg-GFP delvis samlokaliserer med GM-130, og bekrefter at Coll IV er sortert til Golgi før sekresjon. Det observeres imidlertid en økning i signal-til-støy-forholdet og en bedre oppløsning av colokaliseringen mellom Vkg-GFP og GM130 ved bruk av bildebehandling med superoppløsning (sammenlign figur 7A med figur 7C).

Videre, når den romlige fordelingen og nivåene av grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) piksler kvantifiseres ved å måle fluorescensintensiteten til en optisk seksjon gjennom FCs tatt med konfekt (figur 7B) og superoppløsning (figur 7D) mikroskopi, observeres kolokaliseringen av Vkg-GFP og GM-130. Fordelingen av Vkg-GFP og GM-130 piksler er plottet inn i histogrammer der overlappinger av toppene Vkg-GFP og GM-130 indikerer deres colokalisering (figur 7B',D'). Ved hjelp av dette bildeanalyseverktøyet kan plasseringen av Vkg-GFP i spesifikke intracellulære rom bestemmes nøyaktig. Sammenligningen av histogrammer generert fra kondokale bilder (figur 7B)) med superoppløsningsbilder (figur 7D) bekrefter imidlertid at mikroskopi med superoppløsning gir bedre resultater, som det fremgår av den høyere intensiteten av topper og redusert bakgrunnsstøy representert ved mangel på mindre topper (sammenlign figur 7B' og figur 7D' ) knyttet til superoppløsningsgenererte histogrammer. Til sammen fremhever disse dataene at selv om konfokal mikroskopi kan brukes til å kvantifisere colokalisering, er superoppløsning en kraftigere tilnærming, noe som fører til en mer effektiv og presis kvantifisering av lokaliseringen.

Figure 1
Figur 1: Follikulær epitel (FE) av Drosophila eggstokken: et modellsystem for å studere polarisert avsetning av kjellermembran (BM) proteiner. (A) Bilde av intakte eggstokkene etter disseksjon og eksisjon tatt med et fluorescens stereomikroskop. Eggstokkene uttrykker et endogent GFP-merket BM-protein (Vkg-GFP). Skalastang = 1 mm. (A') To eggstokker av en kvinnelig flue er festet ved ovidukten. Hver eggstokk inneholder 16-20 eggstokker. En enkelt ovariole er skissert (rektangel). Skalastang = 1 mm. (B) Langsgående seksjon, tatt med et konfokalt mikroskop, gjennom en ovariol som uttrykker Vkg-GFP og farget for DNA (blå) og F-Actin (rød). Eggarioles består av eggkamre på forskjellige stadier. Eggkamre består av et monolayer follikulært epitel (FE) som omgir bakteriecellene (GCs). FE syntetiserer og utskiller basally BM-proteiner (f.eks. Skalalinje = 100 μm. (C) Skjematisk for FE. FE er et klassisk epitel med en distinkt apikal-basal polaritet der det apikale domenet vender mot bakteriecellene, og basaldomenet vender mot BM (grønn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bildebehandling av intracellulær smugling av BM-proteiner ved hjelp av konfokal avbildning. (A-C) Langsgående seksjon gjennom et eggkammer som uttrykker Vkg-GFP (grønn) og farget for DNA (blå) og F-Actin (rød). (A'-C') Intracellulære rom og vesikler som inneholder Vkg-GFP (piler), og den basalt og ekstracellulært avsatte BM (pilspisser) vises ved hjelp av konfølende mikroskopi. (A) Optimalt ervervet bilde som den intracellulære smuglingen av Vkg-GFP er synlig for. (A') Vkg-GFP er lokalisert i hele cytoplasma av FCs i forskjellige cellulære rom (f.eks. Golgi) og i vesicles. På grunn av fibril-organiseringen av Kollagen IV, vises Vkg-GFP-inneholdende vesikler langstrakte (piler). (B) Undereksponert bilde som oppkjøpsparametrene er optimalisert for å visualisere den ekstracellulære BM og ikke den intracellulære fordelingen av BM-proteiner. Vkg-GFP (grønn) fremstår som svak gjennom cytoplasma (B'), noe som resulterer i uoppdagelige Vkg-GFP-inneholdende vesicles sammenlignet med (A). (C) Overeksponert bilde som GFP-detektoren er mettet for, noe som resulterer i en økning av bakgrunnsfluorescens. Selv om den intracellulære fordelingen av Vkg-GFP (grønn) kan sees lokalisert i hele cytoplasmaet til FCene (piler), resulterer overeksponering i avbildningsartefakter der de intracellulære strukturene ser større ut enn de er, som i (A-A'). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bildebehandling av intracellulær smugling av BM-proteiner ved hjelp av avbildning og prosessering med superoppløsning. (A-C) Langsgående seksjon gjennom et eggkammer som uttrykker Vkg-GFP (grønn) og farget for DNA (blå) og F-Actin (rød). (A) Optimalt behandlet superoppløsningsbilde, der intracellulær smugling av Vkg-GFP er tydelig observert. (A') Vkg-GFP er lokalisert i hele cytoplasma på FCene i forskjellige cellulære rom (f.eks. Golgi) og vesicles (piler) og ved BM (pilspisser). (B) Underbehandlet bilde som resulterer i høyere bakgrunnsfluorescens enn i (A). Den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP (grønn) fremstår som svak og mindre definert (sammenlign B med A). (C) Overbehandlet bilde som resulterer i et bilde der den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP vises pikselert og kornete. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ortogonal projeksjon av en z-stack ervervet og bearbeidet ved hjelp av konfokale og super-oppløsning mikroskopi tilnærminger. (A-B) Ortogonal projeksjon av optiske z-seksjoner gjennom et eggkammer som uttrykker Vkg-GFP (grønn) og farget for DNA (blå) og F-Actin (rød) ved hjelp av konfokal (A) eller superoppløsning (B) mikroskopi. (A) Projeksjon av en z-stack anskaffet ved hjelp av optimale konfokale parametere. Den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP kan observeres gjennom z-aksen i FCene (A', piler). BM er også synlig og vises veldig lyst (A', pilspisser). (B) Projeksjon av en z-stack anskaffet ved hjelp av optimal behandling med superoppløsning. Veldefinerte intracellulære rom og vesikler som inneholder Vkg-GFP kan observeres gjennom z-aksen i FCene (B', piler). BM er også veldig veldefinert (B', pilspisser). Forskjellen mellom standard konfektavbildning og superoppløsningsavbildning er tydelig, ettersom den intracellulære lokaliseringen av Vkg-GFP og BM er betydelig mer definert ved bruk av superoppløsning enn standard konfomisk mikroskopi. Videre har bildet tatt av konfektmikroskopi høyere bakgrunnsfluorescens. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: 3D-rekonstruksjon av en z-stack ervervet og behandlet ved hjelp av konfokale og superoppløselige mikroskopitilnærminger. (A-B) 3D-gjengivelse av z-stabler (blandet visning) av eggkamre som uttrykker Vkg-GFP (grønn) og farget for DNA (blå) og F-aktin (rød). (A) 3D-gjengivelse av en z-stack anskaffet via konfokal mikroskopi. Plasseringen og formen på rom og vesikler som inneholder Vkg-GFP kan ses i hele cellene (A'). (B) 3D-gjengivelse av en z-stack anskaffet via optimal behandling med superoppløsning. Plasseringen og formen på rom og vesikler som inneholder Vkg-GFP kan sees (B'). Formen på vesicles, samt BM og kjernene, er jevnt definert, og oppløsningen er høyere sammenlignet med konfokal mikroskopi (sammenlignet med B' og A'). Formen og størrelsen på rommene og vesiklene som inneholder Vkg-GFP kan også bestemmes bedre ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi (sammenlignet B' og A'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av Vkg-GFP-lokalisering i Crag slo ned FCer. (A-B) Langsgående seksjon gjennom et eggkammer som uttrykker Vkg-GFP (grønn), farget for DNA (blå) og F-Actin (rød) og anskaffet via optimal superoppløsningsbehandling. (A) Kontrollinje som uttrykker wildtype Crag, et protein som er kritisk for riktig BM-avsetning. FE viser typisk BM protein lokalisering, hvor Vkg-GFP er intracellulært distribuert og avsatt basalt i FE (A'). (B) Transgen Drosophila linje som uttrykker RNAi for Crag i FE, noe som resulterer i en Crag knockdown. Tapet av Crag fører til feilfordeling av BM-proteiner (f.eks. Vkg-GFP) apically i FE (B', piler og pilspisser). Super-oppløsning bilde brukes til å karakterisere BM feillokalisering fenotyper forbundet med tap av Crag. Spesielt noen Crag RNAi FCs, viser en sterk apikal feilfordeling av BM-proteiner (B', pilspisser), mens andre Crag RNAi FCs presenterer en svakere apikal feillokalisering (B', piler). Superoppløsningsavbildning avslører tydelig fenotypene forbundet med tapet av Crag (B', pilspisser vs piler). Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Colokalisering av Vkg-GFP og GM-130 (Golgi-markør) ved hjelp av konfokale og superoppløsningsmikroskopitilnærminger. (A-D) Langsgående seksjoner gjennom eggkamre som uttrykker Vkg-GFP og immunostert for en cis-Golgi-markør (GM-130, rød), avbildet med konfokal (A, B) eller superoppløsning (C,D) (A,B) Konfokal avbildning viser at intracellulær Vkg-GFP delvis colocalizes med en cis-Golgi markør (A, pilspiss). (B) Zoomet inn-området i (A). Fordelingene av grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) piksler langs den hvite pilen er tegnet inn i et histogram (B'). X-aksen i histogrammet representerer avstanden (μm) langs pilen mens y-aksen representerer pikselintensitet. De overlappende grønne og røde toppene (*) viser hvor Vkg-GFP og GM-130 colokaliseres. (C,D) Bildebehandling med superoppløsning viser også at intracellulær Vkg-GFP delvis colokaliserer med en cis-Golgi-markør (C, pilspiss). (D) Zoomet inn-området i (C). Fordelingene av grønne (Vkg-GFP) og røde (GM-130) piksler langs den hvite pilen er tegnet inn i et histogram (D'). X-aksen i histogrammet representerer avstanden (μm) langs pilen mens y-aksen representerer pikselintensitet. De overlappende grønne og røde toppene (*) viser hvor Vkg-GFP og GM-130 colokaliseres. Disse dataene viser at bildebehandling med superoppløsning er en mer effektiv og presis tilnærming enn konfokal avbildning for å karakterisere og kvantifisere colokalisering. Skalastenger = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Konfekt- og superoppløsnings mikroskopiinnhentings- og behandlingsparametere for de representative bildene. Alle hovedavbildningsparametrene er kompilert for de angitte representative bildene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese, og voksne fysiologiske funksjoner. Videre fungerer BM som en signalplattform for etablering og vedlikehold av epitel polaritet og gir vev med støtte2. Likevel er mekanismene som regulerer riktig plassering av BM-proteiner dårlig forstått. En bedre forståelse av de biologiske veiene dedikert til intracellulær smugling og polarisert sekresjon av BM-proteiner krever en nøye analyse av komponentene i disse veiene og deres roller i BM-prosessering. En måte å oppnå dette på er å bruke konfikal og superoppløsningsavbildning. Her beskrev vi metoder for fremstilling og farging eller immunstimering av Drosophila-eggstokkene for effektivt å avbilde intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i FE ved hjelp av konfomisk og superoppløsningsmikroskopi.

Fordeler med proteinfelle og endogene merkede proteiner for å visualisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i ville og mutante forhold
Den medfølgende protokollen drar full nytte av proteinfeller og endogene taggede BM-proteiner (f.eks. Vkg-GFP og Pcan-GFP) for å avbilde og vurdere lokalisering og distribusjon av BM-proteiner i FE i villtype (kontroll) og mutantforhold. Disse linjene har viktige fordeler i forhold til bruk av antistoffer mot BM-proteiner. For det første er antistoffer mot spesifikke proteiner av interesse ofte sjeldne og i lav overflod. I tillegg er det ofte problemer med vevsgjennomtjennomheng forbundet med antistoffer som kan føre til unøyaktig observasjon og vurdering av proteinet av interesse. Videre kan proteinfellelinjer settes inn i forskjellig genetikkbakgrunn som brukes til å bestemme funksjonene til faktorer som kreves for riktig avsetning av BM som (i) metoder for å manipulere genuttrykk (f.eks. UAS / Gal4), (ii) mutanter og (iii) RNA-interferenslinjer (RNAi). Til slutt kan disse proteinfellene brukes til å visualisere lokaliseringen og funksjonen til BM ved hjelp av levende avbildning57.

Imidlertid kan blandingen av en fluorescerende tag til et protein av interesse forstyrre lokaliseringen og funksjonene. Dermed er det viktig å evaluere eventuelle avvikende effekter av taggen på proteinet. En måte å sikre at tilsetningen av en fluorescerende tag ikke forstyrrer funksjonen og lokaliseringen av BM-proteiner er å avgjøre om den transgene Drosophila-linjen er homozygot levedyktig. Både Vkg-GFP- og Pcan-GFP-linjene som brukes i de forskjellige eksperimentene som er beskrevet her og tidligere, er homozygote levedyktige, noe som indikerer at tilsetningen av en GFP-tag ikke forstyrrer funksjonen til disse essensielle proteinene29,30.

Betydningen av vevsforberedelse, fiksering og farging for avbildning
For å effektivt og nøyaktig bilde FE, er det viktig å forberede, fikse og flekke eggstokkvevet riktig som anvist i denne metoden. Først, etter disseksjon, fjern forsiktig alle andre organer og fly rusk før fiksering. Bruk av paraformaldehyd (PFA) for å fikse vev anbefales, siden det fører til lys GFP fluorescens og er kompatibel med de fleste antistoffer. PFA er imidlertid kanskje ikke kompatibel med alle antistoffer; noen kan kreve glutaraldehyd eller metanolfiksering. Videre, for å unngå bakgrunnsfluorescens på grunn av ikke-spesifikk binding av det primære antistoffet, bør eggstokkvevet inkuberes på en muterende plattform rocker i minst 1 time i blokkeringsløsning, og vaskes grundig flere ganger etter primær og sekundær antistoffinkubasjon som beskrevet i protokollen. Til slutt er riktig montering av eggstokkvevet viktig for å oppnå optimal avbildning. Dette krever forsiktig separasjon av individuelle eggkamre for å unngå stabling på toppen av hverandre. Det er også viktig å la monteringsmediet polymeriseres helt før avbildning for å unngå å flyte av vevet under dekslene. Dette gjør det også mulig for monteringsmediet å nå sin optimale refleksindeks, noe som er svært viktig for bildebehandling med superoppløsning. Hvis du ikke gjør det, vil det påvirke bildekvaliteten. Videre kan de forberedte lysbildene lagres i opptil 1 måned ved 4 °C, før fluorescensen slukkes. I tillegg til den medfølgende protokollen er flere andre protokoller tilgjengelige for eggstokk disseksjon og farging 53,54,55.

Bruk av riktige anskaffelses- og prosesseringsparametere er avgjørende for optimal avbildning og for å vurdere lokalisering av BM-proteiner ved hjelp av konfikal og superoppløsningsavbildning
Som beskrevet tidligere, er det viktig å angi anskaffelsesparametrene for konfikal og superoppløsningsavbildning for å oppnå optimale bilder av prøven. For bildeanskaffelse må avkastningen velges nøye ved hjelp av zoomfunksjonen, og deretter stille inn rammestørrelsen og anskaffelseshastigheten optimalt. Videre, som illustrert i figur 2, er det viktig å justere laserkraften og detektorforsterkningen på riktig måte for å visualisere intracellulær menneskehandel uten å mette detektorene. Disse parameterne må angis svært nøye for å unngå undereksponerte eller overeksponerte bilder (figur 2). Undereksponerte bilder vil resultere i bilder med lav oppløsning, der de intracellulære strukturene vil være vanskelige å visualisere og karakterisere (figur 2B). Overeksponerte bilder på grunn av metningen av detektoren fører til feiltolkning av data og colokaliseringsartefakter (figur 2C). Hvis målet er å bestemme den vesikulære lokaliseringen av endogene taggede BM-proteiner, metter fluorescensen fra GFP-merkede proteiner (f.eks. Vkg-GFP og Pcan-GFP) i basal BM raskt detektoren. Vesicles som inneholder mindre GFP-merkede BM-proteiner, vil imidlertid virke svake. Derfor er det viktig å stille inn bildefølsomheten ved hjelp av de BM-inneholdende intracellulære strukturene (f.eks. vesikler), og ikke på BM (figur 2). Det er også svært viktig å velge pinhole-størrelse. Ideelt sett bør en pinhole-størrelse på 1 AU for hver kanal velges for bilder av beste kvalitet, spesielt når oppløsningen i z-aksen er viktig. Den mindre pinhole-størrelsen er optimal for tynnere optiske seksjoner. Men når optimal z-akseoppløsning ikke er nødvendig eller en z-stabel ikke fanges opp, kan pinhole-størrelsen økes for å unngå fotobleaching. Videre, for svært svake signaler, kan økning av pinhole-størrelsen hjelpe på grunn av et høyere signal-til-støy-forhold og fangst av flere fotoner, noe som bidrar til datatolkning.

For bildebehandling med superoppløsning bør det tas særlig hensyn til dekonvolusjonsbehandling for å unngå å generere under- eller overbehandlede bilder som er dårlig løst, som vist i figur 3. Til slutt, for å oppnå en optimal 3D-rekonstruksjon, anbefales det sterkt å angi det beste intervallet som bestemmes av programvaren. Et intervall som er for stort mellom z-seksjoner (dvs. høyere enn 0,5 μm) vil føre til dårlig 3D-gjengivelse og vil påvirke den påfølgende analysen av fenotypen.

Fordelen med superoppløsning i forhold til tradisjonell konfektmikroskopi ved avbildning av BM intracellulær menneskehandel
Som illustrert i resultatdelen, selv om lokalisering og distribusjon av BM-proteiner kan vurderes nøyaktig ved hjelp av konfokal avbildning, genererer den beskrevne superoppløsningsmetoden mer presise bildedata med en betydelig økning i oppløsningen av intracellulære strukturer som inneholder BM-proteiner, samt et forbedret signal-til-støy-forhold. Videre er denne mikroskopiteknikken med superoppløsning relativt enkel å bruke. Siden superoppløselig avbildning øker oppløsningen betydelig sammenlignet med konfikal mikroskopi, opptil 120 nm i x- og y-aksene og 350 nm i z-aksen, vil denne tilnærmingen i stor grad påvirke vår forståelse av polarisert avsetning av BM ved mer nøyaktig karakterisering av intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i epitelceller som FCs.

Videre har en annen superoppløsningsavbildningstilnærming (Structured Illumination Microscopy, SIM) og bruk av dekonvolusjonsalgoritmer designet for punktskanning av konfektmikroskopi (dvs. Nikons programvaremodul for forbedret oppløsning) tidligere blitt brukt til å karakterisere rollen til faktorer som er involvert i BM-avsetning29. Den økte oppløsningen knyttet til disse teknikkene har gitt viktig innsikt i vår forståelse av intracellulær smugling av BM-proteiner og organiseringen av BM. Imidlertid presenterer disse tilnærmingene noen begrensninger sammenlignet med Airyscan mikroskopi. For eksempel er SIM ikke veldig effektiv til å skaffe optimale bilder når du skaffer optiske z-seksjoner dypt i vevet. Dette gjør SIM vanskelig å bruke når du screener for nye komponenter som er involvert i BM-avsetning. I tillegg oppnår ikke bruken av dekonvolusjonsalgoritmer som brukes på konfektbilder, samme nivå av superoppløsning. Totalt sett er Airyscan superoppløselig avbildning på fast vev en kraftig og overlegen tilnærming for å studere BM intracellulær smugling og avsetning.

Men som med alle andre superoppløsningsmikroskopier, er noen få ulemper også forbundet med denne tilnærmingen, og må tas i betraktning under avbildning. For det første krever superoppløsningsmodus vanligvis lengre anskaffelsestid for prøven enn konfektmodus. Dermed må anskaffelsesparametrene og interesseområdet settes nøye for å minimere fotobleaching av prøven. Dessuten er bildefiler generert av superoppløsningsmikroskopi mye større enn filer generert av konfektmikroskopi og kan trenge spesialiserte datamaskiner eller servere for bildebehandling og lagring.

Endelig har levende avbildning av BM-proteinene under Drosophila oogenese blitt brukt til å karakterisere nye faktorer involvert i BM polaritet57. Imidlertid har denne tilnærmingen begrensninger, spesielt i oppløsningen av intracellulære strukturer under BM proteinhandel. Superoppløsningsmikroskopi er en kraftig tilnærming til bruk i forbindelse med levende avbildning for å nøyaktig bestemme rollene til identifiserte faktorer i polarisert avsetning av BM-proteiner.

Andre anvendelser av denne metoden for å studere lokalisering av intracellulære komponenter dedikert til bilisk handel ved hjelp av endogene merkede proteiner og superoppløsningsavbildning
Etablering og vedlikehold av vev og organer under utvikling og i en voksen organisme er delvis avhengig av celle-til-celle-signalering og cellulær spenning og vedheft. Disse prosessene er avhengige av intracellulær smugling, endokytose, eksocytose og sekresjon av spesifikke proteiner. Dermed kan metodene beskrevet heri for å dechiffrere intracellulær smugling av BM ved hjelp av endogene merkede proteiner og konfikal og superoppløselig mikroskopi lett tilpasses for å studere hver prosess. Videre gjør brukervennligheten av CRISPR / Cas9-mediert genetisk redigering for å generere endogene merkede proteiner denne tilnærmingen enda mer allsidig og kraftig58.

Til slutt har vi beskrevet metoder for fremstilling og avbildning av BM-proteiner i FE av Drosophila-eggstokken ved hjelp av konfikal og superoppløselig mikroskopi. Disse protokollene kan brukes til screening med høy gjennomstrømning for å identifisere nye komponenter dedikert til riktig plassering av BM-proteiner. Til slutt har ansettelsen av denne metodikken potensial til å gi betydelige bidrag til vår forståelse av hvordan epitelceller kontrollerer polarisert sekresjon av BM-proteiner, en nøkkelprosess i etablering og vedlikehold av epitelarkitektur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige til Julie Merkle for hennes nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant R15GM137236 til O.D. De konfokale og superoppløselige bildene ble anskaffet ved hjelp av en Zeiss LSM 900 med Airyscan 2, kjøpt med NSF MR-tilskudd 2018748.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 183 Kjellermembran Drosophila Eggstokk Epitelium Konfiskert mikroskopi Superoppløselig mikroskopi Menneskehandel
Confocal og Super-Resolution Imaging av polarisert intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner under <em>Drosophila</em> Oogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter