Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila

Summary

La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.

Abstract

La membrana basal (BM), una lámina especializada de matriz extracelular presente en el lado basal de las células epiteliales, es crítica para el establecimiento y mantenimiento de la morfología del tejido epitelial y la morfogénesis de los órganos. Además, el BM es esencial para el modelado de tejidos, sirviendo como una plataforma de señalización y proporcionando fuerzas externas para dar forma a los tejidos y órganos. A pesar de los muchos papeles importantes que desempeña el BM durante el desarrollo normal y las condiciones patológicas, las vías biológicas que controlan el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y cómo la secreción basal conduce a la deposición polarizada de las proteínas BM son poco conocidas. El epitelio folicular del ovario de Drosophila es un excelente sistema modelo para estudiar la deposición basal de proteínas de membrana BM, ya que produce y secreta todos los componentes principales del BM. Las imágenes confocales y de superresolución combinadas con el procesamiento de imágenes en tejidos fijos permiten la identificación y caracterización de factores celulares específicamente involucrados en el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM. Este artículo presenta un protocolo detallado para teñir y obtener imágenes de vesículas que contienen BM y BM depositadas utilizando proteínas marcadas endógenamente en el epitelio folicular del ovario de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar para abordar cuestiones cualitativas y cuantitativas y fue desarrollado para acomodar el cribado de alto rendimiento, lo que permite la identificación rápida y eficiente de los factores involucrados en el tráfico intracelular polarizado y la secreción de vesículas durante el desarrollo del tejido epitelial.

Introduction

La membrana basal (BM) es una lámina delgada de matriz extracelular adherente a células en capas (ECM) crítica para la estructura epitelial y la morfogénesis¹. Comprende ~ 50 proteínas y se encuentra ubicuamente subyacente a las células epiteliales y endoteliales, y entuba las células esqueléticas, lisas y del músculo cardíaco y los adipocitos ^1,2,3. Los tres componentes principales de la BM en el lado basal de las células epiteliales son el colágeno IV, el perlecano y las lamininas. El BM subyace a las células epiteliales y es responsable de muchas funciones, incluida la separación y barrera tisular, el crecimiento y el soporte, y la polarización celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Su papel como plataforma de señalización regula la morfología y diferenciación de las células epiteliales y tejidos durante^el desarrollo ^3,13,14. Además, la mala regulación de la BM y/o una brecha en su integridad son las causas primarias de muchas afecciones patológicas, incluida la metástasis tumoral ^2,15,16. A pesar de las funciones esenciales realizadas por el BM durante la morfogénesis de tejidos y órganos, los componentes de la(s) vía(s) biológica(s) dedicada(s) al tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas BM son vagamente conocidos.

Para estudiar el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y la secreción de proteínas BM por las células epiteliales, el epitelio folicular (FE) del ovario de Drosophila es un poderoso sistema modelo (Figura 1). Un ovario de Drosophila comprende 16-20 estructuras largas, en forma de tubo, llamadas ovarioles (Figura 1A, B)17,18,19. Cada ovariole se puede considerar como una línea de ensamblaje de huevos, con la progresión de edad de las cámaras de huevos (que cada una da lugar a un huevo) que comienza en el extremo anterior y se mueve hacia atrás, hasta que el óvulo maduro sale a través del oviducto. Cada cámara de óvulos está encapsulada por la FE, una monocapa de células foliculares somáticas (FC), que rodea las células de la línea germinal central (GC). La FE está altamente polarizada con una distinta polaridad apical-basal donde el dominio apical se enfrenta a la línea germinal, y las proteínas BM se secretan basalmente^18,19. Los FC secretan activamente todos los componentes principales del BM, incluyendo Colágeno IV, Perlecan y Lamininas^20,21. En las células epiteliales como las FC, los componentes BM se producen y requieren una vía de secreción polarizada especializada para su deposición extracelular. Por ejemplo, en el caso del componente más abundante del BM, el colágeno IV (Coll IV), los detalles que rodean su tráfico intracelular polarizado y su secreción son vagos a pesar de que su producción y deposición son el foco de muchos estudios. Coll IV se traduce en el retículo endoplásmico (RE), que es también donde cada fibrilla, compuesta de tres polipéptidos (dos cadenas α1 y una cadena α2), se ensambla en una triple hélice²². El plegamiento y la función adecuados de Coll IV requieren chaperonas y enzimas ER, incluidas lisil y prolil-hidroxilasas como Plod y PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Estas enzimas posttraduccionales regulan la clasificación ER de Coll IV, ya que la pérdida de cada una hace que Coll IV quede atrapado en el ER basal 20,23,24,25,26. Luego, el Coll IV recién sintetizado sale de la sala de emergencias para el Golgi en vesículas recubiertas de COPII. El receptor de carga Tango1 ayuda a empaquetar colágenos en vesículas de Golgi de gran tamaño que pueden acomodar grandes proteínas multiméricas^20,27. Una vez que Coll IV se empaqueta en vesículas exocíticas intracelulares, se secreta específicamente basalmente de las células epiteliales. Para dirigir la deposición de BM al lado basal, las células epiteliales requieren otro conjunto de factores específicamente dedicados a la secreción de BM polarizada. Utilizando la FE del ovario de Drosophila, se han caracterizado algunos componentes de este novedoso proceso celular, incluidos los factores de intercambio de nucleótidos (GEFs) Crag y Stratum, las GTPasas Rab8 y Rab10, así como los niveles de fosfoinositida PI(4,5)P2, y las proteínas motoras Kinesin 1 y 3 20,28,29,30,31 . Estos componentes son críticos para asegurar la distribución polarizada de las proteínas BM.

Para monitorizar la localización intracelular de las proteínas BM en la FE, se pueden utilizar proteínas de membrana basal marcadas endógenamente (trampas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) y Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. Se ha demostrado que estas líneas trampa de proteínas reflejan con precisión la distribución endógena de las proteínas BM y permiten una detección más sensible del tráfico vesicular^28,30. Los componentes implicados en la deposición polarizada de BM en la FE se caracterizaron por primera vez utilizando líneas trampa de proteínas para Vkg-GFP y Pcan-GFP 20,28,29,30. Las trampas de proteínas se pueden usar en diferentes orígenes genéticos, incluidos mutantes y líneas Gal4 ³⁴. Además, las trampas de proteínas se pueden utilizar en combinación con colorantes fluorescentes y/o inmunotinción de fluorescencia, lo que permite una caracterización precisa de la localización de proteínas BM al comparar condiciones de tipo salvaje y mutante³⁵.

Para evaluar de manera precisa y eficiente la distribución y localización de las vesículas que contienen proteínas BM, la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y las técnicas de imagen de superresolución presentan una ventaja significativa para otros enfoques de imágenes. Estos enfoques combinan imágenes de alta resolución con relativa facilidad de uso. CLSM es una técnica de microscopía que permite una resolución óptica mejorada mediante el escaneo de la muestra con un láser de una manera de escaneo ráster utilizando galvanómetros. La abertura estenopeica es un componente central de un microscopio confocal. Al bloquear las señales desenfocadas que vienen de arriba o por debajo del plano focal, la apertura estenopeica da como resultado una resolución muy superior en el eje z³⁶. Esto también permite obtener una serie de imágenes en el plano z, llamadas z-stack, correspondientes a una serie de secciones ópticas. Posteriormente, las pilas z crean una imagen 3D de la muestra, a través de la reconstrucción 3D, con la ayuda de un software de imágenes. Los microscopios convencionales de epifluorescencia (campo ancho), a diferencia de los microscopios confocales, permiten que la luz desenfocada contribuya a la calidad de la imagen, disminuyendo la resolución de la imagen y el contraste^36,37. Esto hace que la microscopía de epifluorescencia sea un candidato menos atractivo cuando se estudia la localización o colocalización de proteínas.

Aunque CLSM es un enfoque adecuado para diversas aplicaciones, incluidas las imágenes y la caracterización del tráfico intracelular de proteínas BM, todavía presenta un problema cuando se toman imágenes de muestras por debajo del límite de difracción de luz de Abbe (200-250 nm). Al obtener imágenes de tales muestras, la microscopía confocal, especialmente cuando se utiliza un objetivo de aceite, puede dar como resultado una alta resolución. Sin embargo, las técnicas de superresolución superan el límite de la microscopía confocal. Existen varios enfoques para lograr la microscopía de superresolución, cada uno con límites de resolución específicos y cada uno apropiado para diferentes análisis. Estos enfoques incluyen microscopía de localización fotoactivada (PALM) o microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED), microscopía de iluminación estructurada (SIM) y microscopía Airyscan (superresolución) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Aunque Airyscan tiene una resolución más gruesa que PALM / STORM, STED y SIM, aún puede lograr una resolución de hasta ~ 120 nm (aproximadamente el doble de la resolución de CLSM). Además, se ha demostrado que este enfoque de microscopía de superresolución tiene una ventaja sobre la SIM y otras técnicas de superresolución al obtener imágenes de muestras gruesas y muestras con una baja relación señal-ruido^47,48.

Airyscan es una tecnología de microscopía confocal de superresolución relativamente nueva⁴⁶. A diferencia de los CLSM tradicionales, que utilizan los detectores estenopeicos y de un solo punto para rechazar la luz desenfocada, este enfoque de superresolución utiliza un detector de área de tubo fotomultiplicador de 32 canales de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) que recoge toda la luz en cada posición de escaneo⁴⁵. Cada uno de los 32 detectores funciona como un pequeño agujero de alfiler, reduciendo el tamaño del agujero de la unidad aireada (U.A.) tradicional 1.0 a un 0.2 A.U. mejorado, lo que permite una resolución aún mayor y una relación señal-ruido, al tiempo que mantiene la eficiencia de un diámetro⁴⁵ de 1.25 A.U. Además, la deconvolución lineal utilizada por Airyscan da como resultado un aumento de hasta 2 veces en la resolución⁴⁵. Teniendo esto en cuenta, CLSM, y específicamente la microscopía de superresolución, son muy adecuados para estudiar las proteínas BM y las proteínas que regulan la deposición basal de las proteínas BM, ya que pueden producir imágenes de muy alta resolución para estudios de localización y colocalización, proporcionando así nuevos conocimientos sobre los eventos espaciales, temporales y moleculares que controlan estos procesos.

Un enfoque alternativo a la microscopía confocal que se puede utilizar para realizar experimentos de localización es la deconvolución de imágenes. Dado que la microscopía de campo ancho permite que la luz desenfocada llegue a los detectores, se pueden aplicar algoritmos matemáticos y computacionales de deconvolución para eliminar o reasignar la luz desenfocada de las imágenes obtenidas por microscopía de campo ancho, mejorando así la resolución y el contraste de la imagen⁴⁹. Los algoritmos de deconvolución también se pueden aplicar a imágenes confocales para aumentar aún más la resolución y el contraste, produciendo imágenes finales casi comparables a las de la microscopía de superresolución⁵⁰. Airyscan hace uso de la deconvolución basada en el filtro Weiner junto con la reasignación de píxeles de Sheppard, lo que resulta en una resolución espacial altamente mejorada y una relación señal-ruido. En comparación con la microscopía confocal, se observa un aumento de 2x en la resolución en las tres dimensiones espaciales (120 nm en x e y, y 350 nm en z) cuando se utiliza esta técnica de microscopía de superresolución^45,51.

Este manuscrito proporciona protocolos detallados y optimizados para teñir, adquirir y visualizar el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM utilizando la FE del ovario de Drosophila como sistema modelo junto con microscopía confocal y de superresolución. Las líneas de Drosophila que expresan proteínas de membrana basal marcadas endógenamente, por ejemplo, Vkg-GFP y Pcan-GFP, son herramientas eficientes y precisas para visualizar el tráfico y la secreción de proteínas BM. Además, se pueden usar fácilmente en diferentes antecedentes genéticos, incluidas las líneas mutantes y Gal4 / UAS ³⁴. Aunque se recomiendan las proteínas de la membrana basal marcadas endógenamente, el uso de anticuerpos contra proteínas BM específicas también es compatible con los protocolos descritos. Estos protocolos son particularmente útiles para los científicos que están interesados en estudiar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en el tejido epitelial intacto utilizando imágenes confocales y de superresolución. Además, la capacidad de combinar el análisis del tejido epitelial con las herramientas expansivas de la genética Drosophila hace que este enfoque sea especialmente poderoso. Finalmente, estos protocolos podrían adaptarse fácilmente para estudiar el tráfico vesicular y la clasificación de otras proteínas de interés.

Protocol

1. Preparación de moscas para disecciones de ovarios

1. Coloque 10-15 moscas hembra de Drosophila melanogaster (1-2 días de edad) del genotipo deseado en un vial estrecho que contenga ~ 8 ml de mosca mediana de Drosophila rociada con una pequeña cantidad de levadura de panadería granulada 2-3 días antes de la disección a 25 ° C. Agregar algunos machos al vial puede aumentar el rendimiento de la cámara de huevos. Sin embargo, asegúrese de que el número total de moscas no exceda de 20, ya que esto puede afectar negativamente el desarrollo de los ovarios.
   NOTA: La descripción de los hombres y mujeres de Drosophila, y consejos y sugerencias útiles para científicos sin experiencia previa en Drosophila se pueden encontrar en los artículos citados^34,52. Agregar levadura estimulará la producción de óvulos y generará ovarios con diferentes etapas representadas. Además, también engordará los ovarios y los hará más fáciles de extirpar. La levadura húmeda también se puede usar en lugar de la levadura granulada, sin embargo, para las poblaciones más débiles, las moscas pueden atascarse y morir.

2. Disección y fijación de ovarios

NOTA: Para obtener recursos adicionales sobre disección y tinción de ovarios, los lectores son dirigidos a los protocolos citados 53,54,55.

1. El día de la disección, prepare una solución de fijación fresca con una concentración final de paraformaldehído al 4% (PFA) diluyendo la solución madre de PFA en solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x.
2. Anestesiar las moscas usando CO_{2 y colocarlas} en una almohadilla para moscas. Mantenga las moscas anestesiadas hasta la disección. Considere las moscas debidamente anestesiadas una vez que sus movimientos han cesado, lo que generalmente toma 10-20 s.
   NOTA: Aunque se recomienda el uso de CO₂ como una opción más segura y rápida, las moscas se pueden anestesiar con hielo.
3. Coloque un portaobjetos cóncavos de vidrio o un plato de tinción con pozos de depresión poco profundos bajo un microscopio de disección y llene los pozos con 1x PBS.
4. Agarra una mosca hembra en la parte inferior del tórax con un par de fórceps. Asegurar el sexo de las moscas por la ausencia de genitales masculinos en el extremo posterior del abdomen y la ausencia de peines sexuales en sus patas delanteras como característica secundaria⁵². Diseccionar moscas individualmente usando otro par de fórceps (paso 2.5) mientras las sumerge en pozos llenos de 1x PBS bajo el microscopio de disección (se recomienda un aumento de 20x).
5. Mientras mira a través del microscopio de disección, use otro par de fórceps para tirar de la parte posterior del abdomen de la mosca, haciendo que los órganos internos (por ejemplo, ovarios, intestino) sean visibles.
6. Apriete suavemente la parte anterior del abdomen de la mosca (como con un tubo de pasta de dientes) para forzar los ovarios a salir del abdomen. Este método debe mantener los ovarios intactos. Separe y retire cuidadosamente otros órganos y restos de moscas.
7. Usando fórceps o agujas de disección, separe los ovarioles del ovario mientras mantiene intacta la estructura general del ovario. El propósito de este paso es romper la vaina muscular que cubre los ovarios y permitir una tinción más eficiente y homogénea.
8. Transfiera rápidamente los ovarios a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1x PBS y mantenga el tubo en hielo hasta que se diseccionen todas las moscas. No mantenga el tubo en hielo si se van a visualizar microtúbulos o microfilamentos (o vesículas traficadas por estos componentes citoesqueléticos), ya que esto puede causar despolimerización.
9. Una vez que todos los ovarios se diseccionan y se transfieren a un tubo de microcentrífuga, permita que se hundan en el fondo del tubo y elimine todos menos ~ 50 μL del PBS. Agregue 1 ml de PFA al 4% y colóquelo en un balancín de plataforma nutating durante 15 min. Es importante verificar si los ovarios se mueven hacia adelante y hacia atrás en la solución de fijación para permitir una fijación adecuada, ya que la fijación incompleta podría provocar problemas de tinción e imágenes.
   NOTA: La velocidad del nutator no es crucial. Mientras que algunos nutators tienen un control de velocidad, otros vienen con una velocidad preestablecida. La velocidad preestablecida es suficiente y, si es ajustable, se establece en 40-50 rpm.
10. Retire la solución de fijación (como en el paso 2.9) y luego realice dos lavados rápidos con 1 ml de 1 pb pb que contenga 0.1% Triton-X 100 (1x PBST), invirtiendo suavemente los tubos de microfuge 5-6 veces. Luego, proceda con cuatro lavados de 10-15 minutos (lavado largo) con 1 ml de 1x PBST (40-60 min en total).
    NOTA: Se recomienda usar 1x PBS + 0.1% Triton-X 100 para lavados, ya que aumentar el porcentaje de detergente podría resultar en la desnaturalización de GFP, lo que lleva a una disminución de la fluorescencia y la detección de proteínas BM marcadas con GFP.
11. Para la tinción de tinte, por ejemplo, tinción de ADN y F-actina, continúe con el paso 3. Para la inmunotinción, continúe con el paso 4. Los ovarios se pueden almacenar en 1x PBST a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de continuar.

3. Tinción estándar de ADN/F-actina

1. Después de la fijación y el lavado, retire el PBST. Añadir 500 μL de ADN y solución de tinción de F-actina. Para preparar la solución de ADN/F-actina, mezcle Hoechst (tinción de ADN; dilución 1:1000 de solución madre de 1 mg/ml) y faloidina marcada con fluoróforo (tinción de F-actina; dilución 1:500 para Alexa Fluor 546 o dilución 1:100 para Alexa Fluor 647, cada una de 66 μM solución madre) en 500 μL de PBST.
2. Cubra los tubos con papel de aluminio para mantener los ovarios y los tintes en la oscuridad para mantener la fluorescencia para obtener imágenes eficientes e incube en un balancín de plataforma nutating durante 15 minutos.
3. Después de la incubación, retire la solución de ADN/F-actina (como en el paso 2.9). Realice dos lavados rápidos y tres lavados largos (10-15 min) en 1x PBST como se describe en el paso 2.10. Continúe con el montaje como se describe en el paso 5.

4. Inmunotinción por fluorescencia

NOTA: Este es un protocolo de inmunotinción estándar para imágenes fluorescentes y es compatible con la mayoría de los anticuerpos primarios.

1. Bloqueo e inmunotinción primaria de anticuerpos (Día 1)
   1. Después de la fijación y el lavado, retire pbST como se describe en el paso 2.9. Agregue 1 ml de solución de bloqueo (PBS + 5% BSA) y bloquee los ovarios en un balancín de plataforma nutating durante 1 h como mínimo.
      NOTA: Además de BSA, se puede agregar suero fetal bovino (FBS) o suero normal de cabra (NGS) a la solución de bloqueo. Alternativamente, los ovarios se pueden bloquear durante la noche en un balancín de plataforma nutating a 4 ° C.
   2. Retire la solución de bloqueo como en el paso 2.9 y agregue 300 μL de solución de anticuerpo primario que contenga anticuerpos primarios diluidos en sus concentraciones apropiadas (específicas para el anticuerpo utilizado) en la solución de bloqueo. Incubar durante la noche en un balancín de plataforma nutating a 4 °C. Al día siguiente, retire la solución primaria de anticuerpos y proceda a la inmunotinción secundaria de anticuerpos.
      NOTA: Algunos anticuerpos primarios se pueden guardar y reutilizar. En algunos casos, los anticuerpos primarios reutilizados pueden reducir la tinción de fondo, lo que resulta en mejores imágenes. Sin embargo, la reutilización debe probarse para cada anticuerpo para garantizar la eficiencia.
2. Inmunotinción secundaria de anticuerpos (día 2)
   1. Después de retirar la solución primaria de anticuerpos, realice dos lavados rápidos y cuatro lavados largos (10-15 min) como en el paso 2.10. Los lavados repetitivos cuidadosamente realizados con PBST fresco 1x disminuirán el fondo no específico y conducirán a imágenes óptimas.
   2. Retire el PBST como en el paso 2.9 y agregue 500 μL de solución de anticuerpos secundarios que contengan anticuerpos secundarios fluorescentes que detectarán los anticuerpos primarios utilizados. Proteja el tubo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio a partir de este punto para una conservación óptima de la fluorescencia, que es fundamental para la adquisición y el análisis de imágenes.
      NOTA: La solución de anticuerpos secundarios debe contener anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que no se superpongan con proteínas marcadas endógenamente. Por ejemplo, si se usan proteínas marcadas con GFP, se recomienda el uso de anticuerpos secundarios de Alexa Fluor en longitudes de onda rojas o rojas lejanas (por ejemplo, 546, 568 o 647 nm). Los colorantes fluorescentes, como Hoechst y Alexa Fluor 546 o 647 faloidina conjugada, se pueden agregar a la solución secundaria. Estas manchas podrían ser útiles para marcar la estructura celular general (es decir, núcleos y F-actina). Consulte el paso 3.1 para las concentraciones.
   3. Incubar los ovarios en la solución secundaria de anticuerpos en un balancín de plataforma nutating durante 2 h a temperatura ambiente. Realice dos lavados rápidos y cuatro lavados largos (10-15 min) en 1x PBST como en el paso 2.10. Proceda al montaje como en el paso 5.

5. Montaje de ovarios teñidos

NOTA: Este método funciona muy bien si los ovarios están bien desarrollados y abundantes. El montaje cuidadoso de los ovarios en la diapositiva es fundamental para una imagen óptima.

1. Después del último lavado, use una pipeta p1000 para pipetear suavemente los ovarios hacia arriba y hacia abajo en el tubo para separar las cámaras de huevos. Permita que las cámaras de huevos se hundan hasta el fondo manteniendo el tubo en posición vertical durante 5-10 minutos. La separación cuidadosa de las cámaras de huevos individuales es fundamental para lograr una adquisición óptima de la imagen.
2. Retire el PBST con una pipeta Pasteur, dejando ~50 μL. Retire la mayor cantidad posible del PBST restante con una pipeta p200. Agregue dos gotas de medio de montaje, suficientes para extenderse uniformemente en una funda de 22 mm x 22 mm. Los ovarios se pueden almacenar en medio de montaje en tubos de microcentrífuga a 4 °C durante un máximo de 1 mes antes del montaje.
   NOTA: Varios medios de montaje diferentes están disponibles comercialmente; se recomienda el uso de montadores de ajuste duro, como Aqua-Poly/Mount o ProLong Glass Antifade Mountant, para lograr condiciones óptimas de imagen. Se desaconseja el uso de glicerol como medio de montaje, ya que puede conducir a malas condiciones de imagen (por ejemplo, inestabilidad del fluoróforo). Para los medios de montaje que no polimerizan, selle el estuche con un sellador de labios / esmalte de uñas para asegurarlo en su lugar.
3. Etiquete un portaobjetos de vidrio y límpielo con papel suave y libre de polvo para eliminar el polvo y las huellas dactilares. Corte el extremo de la punta de una pipeta p200 para permitir una fácil transferencia del medio de montaje viscoso a la corredera desde el tubo de la microcentrífuga. A continuación, transfiera lentamente todas las cámaras de huevos en el medio de montaje al portaobjetos de vidrio, asegurándose de no crear burbujas.
4. Bajo un microscopio de disección, extienda suavemente el medio de montaje y separe las cámaras de huevos utilizando una nueva punta p200 o fórceps para cubrir un área aproximadamente del tamaño de la cubierta.
5. Usando fórceps, coloque cuidadosamente la funda (limpiada con papel sin polvo) en las cámaras de huevos en ángulo para evitar burbujas.
6. Guarde el portaobjetos a temperatura ambiente en una superficie plana en la oscuridad durante 2 días para polimerizar. Una vez que el medio de montaje se ha curado, la diapositiva se puede almacenar a 4 ° C en la oscuridad durante unas semanas para obtener imágenes.
   NOTA: Es importante que el medio de montaje de ajuste duro polimerice antes de obtener imágenes. Si el medio aún no se ha polimerizado, los ovarios flotarán bajo la cubierta, afectando la adquisición de imágenes. Además, el índice reflectante óptimo de los medios de montaje solo se logra después de que se haya establecido completamente (consulte la información del fabricante para obtener más detalles).
7. Método de montaje alternativo: Este método se recomienda para reducir la pérdida de tejido si los ovarios no son abundantes. En este método (descrito a continuación), separe los ovarioles y las cámaras de huevos en el portaobjetos mientras se montan, en lugar de separarlos en un tubo de microcentrífuga mediante pipeteo como se describe en el paso 5.1.
   1. Después del último lavado, retire todos menos ~ 100 μL de la solución de lavado. Usando una pipeta Pasteur o una pipeta p1000, transfiera los ovarios intactos en PBS a la diapositiva. Usando una pipeta p200, retire cuidadosamente la mayor cantidad posible de PBST de la diapositiva. Use un papel libre de polvo para limpiar el PBST, si es necesario. No toque los ovarios.
   2. Agregue dos gotas de medios de montaje. Separe cuidadosamente los ovarioles y las cámaras de huevos usando fórceps o agujas de disección. Retire y deseche el tejido extraño, y luego extienda las cámaras de huevos y los ovarioles en el medio de montaje. Continúe con los pasos 5.5-5.6.

6. Adquisición de imágenes confocales

NOTA: Esta sección proporciona parámetros clave para lograr una adquisición óptima de imágenes utilizando cualquier microscopio confocal (Figura 2).

1. Configure el microscopio y localice la muestra como se describe a continuación.
   1. Antes de obtener imágenes, es crucial localizar la región de interés (ROI) utilizando el ocular del microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de aumento bajo (20x) o el objetivo que se utilizará para la adquisición de imágenes (es decir, 40x o 63x). Seleccione una cámara de huevos para obtener una imagen.
      NOTA: Para la adquisición de imágenes, se recomienda utilizar objetivos de gran aumento, como 40x o 63x (ver 6.2.1).
   2. Una vez seleccionado el ROI, proceda a la adquisición de imágenes; continúe con el paso 6.2 para imágenes confocales y el paso 7 para imágenes de superresolución.
2. Seleccione los parámetros clave para la adquisición óptima de imágenes como se describe a continuación (en la Tabla 1 se dan ejemplos de parámetros clave para las imágenes representativas).
   1. Selección de un objetivo: Para la adquisición de imágenes confocales del tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en la FE, utilice un objetivo 40x o 63x.
      NOTA: Para lograr la mejor resolución posible, se recomienda encarecidamente el uso de objetivos Plan-Apochromat, con alta apertura numérica (NA) que proporcionen la mayor corrección acromática.
   2. Selección de láseres para cada canal/pista: Para GFP, utilice láser de 488 nm; para DAPI u Hoechst, utilice láser de 405 nm; para Alexa Fluor 546 o 568, use láser de 561 nm; y para Alexa Fluor 647, use láser 640 nm.
      NOTA: Cada selección láser dará como resultado una formación de canal / pista diferente. Aquí, el término canal se refiere a la imagen formada por la distribución de intensidad registrada para fluoróforos excitados para el ROI seleccionado en la longitud de onda específica de cada canal.
   3. Ajuste estenopeico: Para reducir la luz desenfocada durante la adquisición de la imagen, ajuste el agujero de alfiler para cada canal en 1 UA.
   4. Intensidad del láser y ajustes de ganancia del detector: Para ajustar la sensibilidad de la imagen, utilice tanto la ganancia maestra del detector como la potencia del láser. Para establecer correctamente la sensibilidad de la imagen, se recomienda un indicador de rango. Configure tanto la ganancia maestra como la potencia del láser para que tengan una sensibilidad adecuada donde las estructuras de interés (por ejemplo, vesículas que contienen BM) sean claramente visibles, evitando al mismo tiempo la saturación del detector.
      NOTA: Para evitar el fotoblanqueo, utilice la potencia láser mínima necesaria. Se recomienda aumentar primero la ganancia del detector mientras se utiliza la potencia láser más baja posible. Si un aumento de la ganancia del detector no puede alcanzar la intensidad deseada, aumente la potencia del láser. Se recomienda una intensidad de potencia del láser entre 0.5% -1.2%.
   5. Tamaño de fotograma: se recomienda utilizar el tamaño de imagen óptimo determinado por el software de adquisición. Para la mayoría de las aplicaciones, utilice una resolución máxima de 1024 x 1024. Una mayor resolución aumentará significativamente el tiempo de adquisición.
   6. Velocidad de escaneo: Use una velocidad de escaneo entre 6-9, que es segura para la mayoría de las muestras. Si la muestra es ruidosa, utilice una velocidad de escaneo más lenta para mejorar las relaciones señal-ruido. Sin embargo, las bajas velocidades de escaneo aumentan el fotoblanqueo y el tiempo de adquisición.
   7. Promedio de intensidad media: Para mejorar la calidad de la imagen, utilice el promedio de intensidad media a través de escaneos sucesivos con configuraciones idénticas. Para la mayoría de los casos, use un promedio de dos para mejorar las relaciones señal-ruido sin fotoblanquear la muestra.
   8. Zoom: Ajuste el área de escaneo usando la función de zoom. Utilice un zoom entre 2x-4x con objetivos de 40x y 63x como el valor más efectivo para visualizar claramente las vesículas que contienen BM en el FE. Seleccione cuidadosamente el ROI mínimo para reducir el tiempo de adquisición.
3. Para adquirir una pila z con el software Zeiss Zen, utilice los siguientes parámetros de sección Z y configúrelos como se describe a continuación.
   NOTA: Las vesículas y otras estructuras intracelulares que contienen proteínas BM son estructuras tridimensionales (3D). La adquisición de una pila z a través del FE mejorará significativamente la calidad y la resolución de la imagen. Por lo general, un rango que abarca el grosor / profundidad del tejido es suficiente para visualizar eficientemente la localización intracelular. Para una reconstrucción 3D óptima, se recomienda utilizar el intervalo óptimo que determina el software. Para objetivos de 40x y 63x, evite intervalos superiores a 0,5 μm entre cada sección z para permitir una reconstrucción 3D óptima.
   1. Haga clic en la casilla de verificación z-Stack en el área principal debajo de la pestaña Adquisición . Seleccione el modo de escaneo Todas las pistas por segmento para la pila z. Esto dará como resultado un cambio en las pistas de canal para cada segmento de posición z.
   2. Seleccione el canal deseado para observar la muestra y haga clic en Live para iniciar un escaneo en vivo. Se recomienda el uso del canal necesario para detectar la proteína BM marcada con GFP.
   3. Establezca un rango para la pila z como se describe. Usando la perilla de ajuste fino en el microscopio, busque la ubicación z para un extremo de la muestra y haga clic en Establecer primero. Del mismo modo, busque la ubicación z para el otro extremo de la muestra y haga clic en Establecer último.
   4. Para cada ubicación en la pila z, haga clic en cada canal por separado con el indicador de rango seleccionado y ajuste la intensidad del láser y la ganancia maestra según sea necesario, como se describe en el paso 6.2.4.
   5. Establezca el intervalo para que la pila z asigne el tamaño del paso como se recomienda en la NOTA a continuación del paso 6.3. Haga clic en Iniciar experimento para comenzar la adquisición de z-stack.

7. Adquisición de imágenes de superresolución

1. Seleccione un objetivo compatible con Airyscan. Para visualizar la localización intracelular de la proteína BM, el uso de un objetivo de aceite 63x es óptimo (Figura 3). Ajuste el objetivo a 63x y coloque suavemente una gota de aceite de inmersión en su lente. Coloque la diapositiva en el objetivo con el deslizamiento hacia el objetivo para localizar la muestra.
2. Seleccione una configuración con los ajustes adecuados para que el fluoróforo se muestre como se describe a continuación.
   1. Haga clic en el botón Configuración inteligente en la pestaña Adquisición para configurar un nuevo experimento. Seleccione Airyscan (superresolución); cuando se selecciona, se requerirá una selección adicional entre Resolución (Airyscan SR), SNR/sensibilidad (Airyscan Confocal) y Velocidad (Multiplex SR-2Y). Para el tejido fijo, seleccione Resolución , ya que eso dará como resultado la mejor adquisición.
   2. Haga clic en + en el cuadro Configurar su experimento para agregar pistas / canales. Seleccione las pistas para tintes específicos de la base de datos de tintes. Para un experimento multicanal, agregue cada pista según sea necesario seleccionando los tintes apropiados.
   3. Después de agregar todas las pistas, seleccione una de las propuestas de experimento proporcionadas por el software. Para este experimento, use Best Signal, ya que aunque la velocidad será un poco más lenta en comparación con la propuesta Smartest (Line), creará la mejor configuración de hardware para cada tinte, lo que resultará en la máxima ganancia de señal y la diafonía de emisión mínima. Una vez que el experimento se haya configurado y cargado, aparecerá en la ventana Configuración de imágenes en la pestaña Adquisición.
   4. Una vez que se selecciona una configuración inteligente, se seleccionará automáticamente el rango de longitudes de onda para el detector GaAsP-PMT. Ajuste el rango moviendo la barra de desplazamiento en la parte inferior para aumentar o disminuir el rango o mover completamente el rango a otra región según sea necesario. Use esto para asegurarse de que los rangos de dos canales diferentes no se superpongan para evitar la diafonía. Guarde la configuración para reutilizarla en el futuro.
3. Una vez establecida la configuración, proceda a ajustar el zoom y el área de escaneo como en el paso 6.2.8. Optimice el área de escaneo para centrarse en la región de interés para reducir el tiempo de escaneo y el espacio de almacenamiento. Proceda a adquirir imágenes.
4. Para cada canal individual, seleccione una pista en Canal y haga clic en En vivo. Ajuste la ganancia maestra y la potencia del láser utilizando la herramienta indicadora de rango como se describe en el paso 6.2.4 y siga todas las pautas descritas para evitar píxeles saturados. Confirme que la vista del detector hexagonal está centrada y alineada haciendo clic en el botón Vista del detector Airyscan . En la mayoría de los casos, la vista del detector hexagonal se centra y alinea automáticamente. Repita para canales adicionales.
5. En la ventana de alternancia Modo de adquisición, en Tamaño de imagen, haga clic en SR (recuento de píxeles de súper resolución limitada) para maximizar las capacidades del detector. Esto ajustará el tamaño del marco automáticamente.
6. Mantenga el promedio a Ninguno , ya que generalmente no es necesario, y esto disminuirá el tiempo de escaneo. En algunos casos, un promedio de 2x puede mejorar la relación señal-ruido.
7. Recopile datos sin procesar con profundidades de datos de 8 bits. Haga clic en Ajustar para adquirir una imagen. Para adquirir una pila z, siga el paso 6.3.
8. Realice el procesamiento de imágenes como se describe a continuación. Esto producirá una imagen de 16 bits.
   1. Una vez obtenida la imagen o la pila z, haga clic en el Método de > de procesamiento y seleccione Procesamiento Airyscan.
   2. Realice el filtro automático para comenzar y realice un procesamiento manual adicional cambiando el valor SR para obtener los mejores resultados para la muestra. Una vez que se haya determinado el valor SR óptimo, haga clic en Aplicar para generar una imagen procesada. En el caso de las imágenes z-stack, procese como un z-slice (Imagen actual [2D]) o como toda la z-stack haciendo clic en el cuadro Procesamiento 3D .

8. Procesamiento de imágenes y análisis de datos (proyección ortogonal, reconstrucción 3D y perfil de intensidad)

NOTA: Para este método, los pasos utilizados para generar proyecciones ortogonales, reconstrucciones 3D y perfiles de intensidad se describen para el software Zen (consulte la Tabla de materiales). También se pueden realizar análisis de datos similares con el software ImageJ⁵⁶.

1. Realizar proyección ortogonal como se describe a continuación (Figura 4).
   1. Una vez que se ha obtenido una pila z utilizando microscopía confocal o de superresolución, genere una proyección ortogonal para ver las vesículas en el eje z de la célula en una vista 2D (en comparación con la reconstrucción 3D). Para hacer esto, haga clic en el Método de procesamiento > y seleccione Proyección ortogonal.
   2. En Parámetros, seleccione el plano de proyección requerido. Para una proyección del eje z (pila z), seleccione el plano Frontal (XY ). En Método, seleccione Máximo para obtener la proyección de la más alta calidad.
   3. A continuación, determine el grosor de la proyección seleccionando la posición inicial (corte z inicial) y determine el grosor (número total de cortes z) en la proyección. Es ideal seleccionar el grosor igual al de una celda en el eje z.
   4. Una vez establecidos los parámetros, haga clic en Aplicar para crear la proyección de la pila z de forma plana XY.
      NOTA: Al crear proyecciones ortogonales de múltiples pilas z para comparar la cantidad de un objeto particular de interés, es imperativo mantener el grosor de la proyección igual (o lo más cerca posible) para la precisión de los datos.
2. Realice la reconstrucción 3D como se describe a continuación (Figura 5).
   1. Cree reconstrucciones 3D de pilas z para observar la localización y la forma de las estructuras. Haga esto para las pilas z adquiridas utilizando enfoques confocales y de superresolución. Procese primero las pilas z de superresolución utilizando el procesamiento 3D como en el paso 7.8 para la reconstrucción 3D.
   2. Para generar una imagen 3D, haga clic en el icono 3D en la ventana de vista previa. Una vez hecho clic, aparecerá una pestaña 3D en la sección de control de pantalla en la mitad inferior de la pantalla. Las vistas 3D, como Transparencia, Volumen, Máximo, Superficie y Mixto, serán visibles. Utilice las vistas Superficie o Mixta al ver la estructura de las vesículas (preferible).
   3. Para obtener la imagen de la más alta calidad, seleccione la configuración Precisa , ya que la configuración más rápida será menos precisa y dará lugar a una representación 3D deficiente.
   4. Una vez generada la imagen, manipularla girando y haciendo zoom para enfocar en una ubicación preferida para ver los objetos de interés. Manipule la imagen 3D en la pestaña Apariencia .
   5. Una vez que se haya obtenido una vista satisfactoria, en la pestaña 3D, seleccione Resolución mostrada y luego haga clic en Crear imagen. Esto creará una instantánea de la imagen en la misma orientación en la que se vio y se puede guardar y exportar en varios formatos de archivo.
3. Genere un perfil de intensidad como se describe a continuación (Figura 7).
   NOTA: Los perfiles de distribución e intensidad de los píxeles asociados a las diferentes señales fluorescentes se pueden ver como una imagen superpuesta para determinar su colocalización.
   1. Una vez que se ha adquirido una imagen óptima a través de imágenes confocales o de superresolución, en el panel Ver de la ventana Vista previa , haga clic en Perfil. En la ventana de vista previa, aparecerá un histograma que muestra el perfil de intensidad en función de la distancia, así como una tabla que muestra las distancias y los valores de intensidad.
   2. En el área de controles de visualización en la parte inferior de la pantalla, haga clic en la herramienta de flecha en la pestaña Definición de perfil . Dibuje una flecha a lo largo de la longitud del objeto para la cual se debe evaluar el perfil de intensidad de los diferentes píxeles. Para dibujar la flecha, amplíe la imagen.
   3. El perfil de intensidad aparecerá a la izquierda de la vista previa de la imagen, donde se mostrará la distancia y los picos correspondientes a lo largo de la trayectoria de la flecha. Para eliminar el histograma que se muestra en la propia imagen, desactive la casilla Mostrar perfil en gráficos .
   4. En la ficha Dimensiones del área de control de visualización, anule la selección de los canales que no vayan a incluirse en el perfil de intensidad.
   5. En la pestaña Gráficos , haga doble clic en Perfil que se muestra debajo del cuadro Anotaciones/Medidas para abrir el cuadro emergente Formato de elementos gráficos . Utilice esta opción para cambiar el color de la flecha, así como su estilo y grosor de trazo. Cierre el cuadro después de seleccionar la configuración deseada.
   6. Haga clic en la pestaña Vista de perfil . En la sección nueva imagen, haga clic en Vista actual y luego en Guardar como para guardar el archivo. Se recomienda guardar el archivo como un archivo .tif para evitar la compresión y pérdida de datos.

Representative Results

Los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para obtener imágenes y caracterizar de manera eficiente y precisa el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en células epiteliales polarizadas, como la FE del ovario de Drosophila . A continuación, proporcionamos resultados anticipados obtenidos utilizando los métodos descritos, así como consejos útiles y posibles dificultades. Para ello, se utiliza Vkg-GFP, un Vkg etiquetado endógenamente (Drosophila Col IV). Sin embargo, los mismos resultados se pueden lograr con otras proteínas BM marcadas endógenamente como Pcan-GFP.

Establecimiento de parámetros de adquisición óptimos (Figura 2)
Para caracterizar con precisión el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM, como Vkg y Pcan, en células epiteliales, es fundamental establecer adecuadamente los parámetros de adquisición del microscopio confocal como se describe en los métodos proporcionados.

Mediante microscopía confocal, la localización intracelular de Vkg-GFP puede detectarse antes de ser secretada y depositada basalmente en la FE (Figura 2A). Se ha demostrado que después de la traducción en el RE, Coll IV se transporta al Golgi antes de ser empaquetado en vesículas exocíticas intracelulares. Usando este enfoque de imagen, observamos que Vkg-GFP se acumula en compartimentos intracelulares con diferentes formas, potencialmente representando diferentes orgánulos, compartimentos endosomales y tipos de vesículas (Figura 2A, flechas). En vesículas exocíticas, Coll IV ya está ensamblado en fibrillas compuestas por tres polipéptidos: dos cadenas α1 y una cadena α2 (Vkg en Drosophila), lo que lleva a la formación de vesículas estiradas que también se pueden visualizar mediante imágenes confocales (Figura 2A, flechas). Luego, Coll IV se secreta específicamente basalmente de las células epiteliales donde se deposita en el BM (Figura 2, puntas de flecha).

Si los parámetros de adquisición no se establecen correctamente, no es posible observar con precisión las diferentes morfologías y posiciones durante el tráfico intracelular de proteínas BM (Figura 2B,C). Por ejemplo, si los parámetros de adquisición están optimizados para visualizar el BM extracelular y no las estructuras intracelulares, los compartimentos endosomales y vesículas que contienen proteína BM (aquí marcadas por Vkg-GFP) parecen tenues o no son visibles (Figura 2B). Por el contrario, si los detectores están demasiado saturados, la localización intracelular de Vkg-GFP se puede detectar como en la condición óptima (compare la Figura 2A y la Figura 2C), pero un aumento en el ruido de fluorescencia de fondo hace que la interpretación de la localización de la proteína BM sea más difícil, particularmente para experimentos de colocalización (ver Figura 7 ). En general, estos datos ilustran la importancia de los parámetros de adquisición adecuados para lograr una localización precisa de las proteínas BM en el epitelio.

Establecimiento de parámetros óptimos de superresolución y deconvolución (Figura 3)
Como se ilustra para la adquisición de imágenes confocales, también es fundamental establecer correctamente los parámetros de adquisición cuando se utiliza la microscopía de superresolución para evitar la saturación insuficiente o excesiva. Este enfoque de imágenes de superresolución también implica la configuración cuidadosa de los parámetros de deconvolución para lograr imágenes de superresolución (Figura 3). Cuando el procesamiento de la deconvolución se configura de manera óptima, las imágenes de superresolución aumentan significativamente la resolución de las estructuras intracelulares que contienen proteínas BM (Figura 3A, flechas), como las vesículas o las estructuras de Golgi (Figura 3A y Figura 7C), el propio BM (Figura 3A, puntas de flecha) y mejora la relación señal-ruido⁴⁵ . La microscopía de superresolución conduce a un aumento de ~ 2 veces en la resolución en las tres dimensiones espaciales en comparación con la microscopía confocal. Este aumento en la resolución se ilustra claramente por las imágenes mejor definidas del tráfico intracelular de proteínas BM y el BM tomadas utilizando imágenes de superresolución en comparación con las tomadas con CSLM estándar (compare la Figura 2A y la Figura 3A).

Si los parámetros de deconvolución no se establecen correctamente, la superresolución no se logra de manera óptima y se pierde el aumento de la resolución. El procesamiento insuficiente de las imágenes de superresolución conduce a imágenes borrosas, lo que resulta en que la localización intracelular de las proteínas BM parezca tenue y no tan bien definida como en condiciones óptimas (compare la Figura 3B con la Figura 3A). Por el contrario, el sobreprocesamiento de las imágenes conduce a imágenes granuladas, donde la localización intracelular de las proteínas BM aparece pixelada (Figura 3C). Estos datos resaltan la importancia de utilizar parámetros de deconvolución adecuados para lograr imágenes significativas y representativas que reflejen la distribución intracelular de las proteínas BM.

En conjunto, estos datos muestran y destacan claramente la resolución mejorada del tráfico intracelular de proteínas BM utilizando el procesamiento de imágenes de superresolución en comparación con la microscopía confocal. Específicamente, este enfoque permite una mejor visualización del tráfico intracelular de proteínas BM al mejorar la resolución de las estructuras intracelulares involucradas. Esto permite la comparación de diferentes tamaños y formas de estructuras para identificar y caracterizar mejor los nuevos factores implicados en la deposición polarizada de proteínas BM en la FE.

Proyección ortogonal y reconstrucción 3D de secciones z ópticas (z-stack) a través de la FE para mejorar la visualización de la distribución intracelular de las proteínas BM (Figura 4 y Figura 5)
Dado que la distribución intracelular de las proteínas BM está presente en toda la FE en 3D (ejes x, y y z), la proyección ortogonal y / o la reconstrucción 3D de las secciones Z ópticas a través de la FE, utilizando microscopía de superresolución o confocal, se pueden usar para evaluar la localización y la distribución de las proteínas BM dentro de células de tipo salvaje o mutantes (por ejemplo, en la Figura 4 y la Figura 5).

La proyección ortogonal permite proyectar todas las secciones Z adquiridas en un solo plano. Este método es particularmente útil para mostrar la distribución general de vesículas y compartimentos que contienen proteínas BM en una sola imagen utilizando imágenes confocales (Figura 4A) o de superresolución (Figura 4B). Sin embargo, una resolución significativamente mejor y un menor ruido de fondo resultan cuando se usa microscopía de superresolución que microscopía confocal (compare la Figura 4B y la Figura 4A).

Otro enfoque para visualizar la distribución general de los compartimentos y vesículas que contienen BM es generar una reconstrucción 3D ensamblando una pila de secciones z ópticas tomadas por imágenes confocales (Figura 5A) o de superresolución (Figura 5B). Este enfoque también puede ser muy eficiente para evaluar la localización y distribución de proteínas BM intracelulares y la forma de compartimentos y vesículas que contienen Vkg-GFP, particularmente cuando se utiliza microscopía de superresolución (Figura 5). La microscopía confocal tradicional (Figura 5A) da como resultado un mayor ruido de fondo en comparación con la superresolución (Figura 5B), que cuando se contabiliza en la representación 3D puede dar lugar a artefactos. Además, la menor resolución de confocal también da como resultado que las imágenes creadas sean menos suaves y definidas que las generadas por superresolución (compare la Figura 5A y la Figura 5B).

Caracterización de los fenotipos asociados a la pérdida de componentes implicados en la secreción polarizada de proteínas BM mediante imágenes de superresolución (Figura 6)
Como se ha mostrado hasta ahora (Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5), la microscopía de superresolución y el procesamiento de imágenes se pueden utilizar para evaluar la localización intracelular y la distribución de las proteínas BM en el tipo salvaje FE del ovario de Drosophila . Además, este enfoque también se puede utilizar para determinar y comparar la localización de proteínas BM en condiciones mutantes o de derribo. Esto, por lo tanto, es un método eficiente para caracterizar el papel (s) de los componentes recientemente identificados dedicados al tráfico intracelular polarizado, la secreción y la deposición de proteínas BM.

Se ha demostrado que el factor de intercambio GTPasa (GEF) Crag es un componente clave en una vía biológica dedicada a la deposición polarizada de proteínas BM²⁸. En los FC de derribo de Crag , las proteínas BM se acumulan tanto apical como basalmente, lo que indica que Crag controla la secreción polarizada de proteínas BM como Vkg-GFP (Figura 6). El uso de microscopía de superresolución permite una mejor caracterización del fenotipo resultante de la pérdida de Crag. Por ejemplo, se observa una fuerte acumulación apical de proteínas BM, así como la organización del BM apical ectópico, en los FC Crag-knockdown (Figura 6B, puntas de flecha). Además, cuando el fenotipo es menos aberrante, se detecta la acumulación de membrana BM apicalmente en pequeños parches en FCs (Figura 6B, flechas). En conjunto, estos datos ilustran que la microscopía de superresolución se puede utilizar para caracterizar fenotipos mutantes para comprender mejor las funciones de los componentes involucrados en la deposición polarizada de BM.

Experimento de colocalización utilizando anticuerpos y proteínas BM marcadas endógenamente mediante microscopía confocal y de superresolución (Figura 7)
Finalmente, el uso de anticuerpos contra marcadores intracelulares específicos o componentes recientemente identificados combinados con proteínas BM marcadas endógenamente se puede utilizar para caracterizar mejor el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en el epitelio polarizado. GM-130, un marcador cis-Golgi, se utiliza para ilustrar este punto. Antes de ser empaquetado en vesículas de secreción, coll IV es transportado al Golgi. Cuando la distribución subcelular de Vkg-GFP se evalúa utilizando imágenes confocales (Figura 7A, B) o de superresolución (Figura 7C, D), ambos enfoques muestran que Vkg-GFP se colocaliza parcialmente con GM-130, lo que confirma que Coll IV se clasifica en el Golgi antes de la secreción. Sin embargo, se observa un aumento en la relación señal-ruido y una mejor resolución de la colocalización entre Vkg-GFP y GM130 cuando se utilizan imágenes de superresolución (compare la Figura 7A con la Figura 7C).

Además, cuando la distribución espacial y los niveles de píxeles verdes (Vkg-GFP) y rojos (GM-130) se cuantifican midiendo la intensidad de fluorescencia de una sección óptica a través de FC tomados con microscopía confocal (Figura 7B) y superresolución (Figura 7D), se observa la colocalización de Vkg-GFP y GM-130. La distribución de los píxeles Vkg-GFP y GM-130 se traza en histogramas en los que las superposiciones de los picos Vkg-GFP y GM-130 indican su colocalización (Figura 7B', D'). Por lo tanto, utilizando esta herramienta de análisis de imágenes, se puede determinar con precisión la ubicación de Vkg-GFP en compartimentos intracelulares específicos. Sin embargo, la comparación de histogramas generados a partir de imágenes confocales (Figura 7B') con imágenes de superresolución (Figura 7D') confirma que la microscopía de superresolución produce mejores resultados, como se puede ver por la mayor intensidad de los picos y la reducción del ruido de fondo representado por la falta de picos más pequeños (compare la Figura 7B' y la Figura 7D' ) asociado con histogramas generados por superresolución. En conjunto, estos datos destacan que, aunque la microscopía confocal se puede utilizar para cuantificar la colocalización, la superresolución es un enfoque más poderoso, que conduce a una cuantificación más eficiente y precisa de la localización.

Figura 1: El epitelio folicular (FE) del ovario de Drosophila : un sistema modelo para estudiar la deposición polarizada de proteínas de la membrana basal (BM). (A) Imagen de ovarios intactos después de la disección y escisión tomada con un estereomicroscopio de fluorescencia. Los ovarios expresan una proteína BM endógena marcada con GFP (Vkg-GFP). Barra de escamas = 1 mm. (A') Dos ovarios de una mosca hembra están unidos al oviducto. Cada ovario contiene 16-20 ovarioles. Se delinea un solo ovariole (rectángulo). Barra de escala = 1 mm. (B) Sección longitudinal, tomada con un microscopio confocal, a través de un ovario que expresa Vkg-GFP y teñida para ADN (azul) y F-Actina (rojo). Los ovarioles consisten en cámaras de huevos en diferentes etapas. Las cámaras de huevo están compuestas por un epitelio folicular monocapa (FE) que rodea las células de la línea germinal (GC). El FE sintetiza y secreta basalmente proteínas BM (por ejemplo, Pcan y Vkg). Barra de escala = 100 μm. (C) Esquema de la FE. El FE es un epitelio clásico con una polaridad apical-basal distinta donde el dominio apical se enfrenta a las células de la línea germinal, y el dominio basal se enfrenta al BM (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Obtención de imágenes del tráfico intracelular de proteínas BM utilizando imágenes confocales. (A-C) Sección longitudinal a través de una cámara de huevo que expresa Vkg-GFP (verde) y se tiñe para ADN (azul) y F-Actina (rojo). (A'-C') Los compartimentos intracelulares y las vesículas que contienen Vkg-GFP (flechas), y el BM (puntas de flecha) depositado basal y extracelularmente se muestran mediante microscopía confocal. (A) Imagen adquirida de manera óptima para la cual es visible el tráfico intracelular de Vkg-GFP. (A') Vkg-GFP se localiza en todo el citoplasma de los FC en diferentes compartimentos celulares (por ejemplo, Golgi) y en vesículas. Debido a la organización de las fibrillas del colágeno IV, las vesículas que contienen Vkg-GFP aparecen alargadas (flechas). (B) Imagen subexpuesta para la cual los parámetros de adquisición están optimizados para visualizar el BM extracelular y no la distribución intracelular de las proteínas BM. Vkg-GFP (verde) aparece tenue en todo el citoplasma (B'), lo que resulta en vesículas indetectables que contienen Vkg-GFP en comparación con (A). (C) Imagen sobreexpuesta para la cual el detector GFP está saturado, lo que resulta en un aumento de la fluorescencia de fondo. Aunque la distribución intracelular de Vkg-GFP (verde) se puede ver localizada en todo el citoplasma de las FC (flechas), la sobreexposición da como resultado artefactos de imagen donde las estructuras intracelulares parecen más grandes de lo que son, como en (A-A'). Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Obtención de imágenes del tráfico intracelular de proteínas BM utilizando imágenes y procesamiento de superresolución. (A-C) Sección longitudinal a través de una cámara de huevo que expresa Vkg-GFP (verde) y se tiñe para ADN (azul) y F-Actina (rojo). (A) Imagen de superresolución procesada de manera óptima, en la que se observa claramente el tráfico intracelular de Vkg-GFP. (A') Vkg-GFP se localiza en todo el citoplasma de los FC en diferentes compartimentos celulares (por ejemplo, Golgi) y vesículas (flechas) y en el BM (puntas de flecha). (B) Imagen subprocesada que resulta en una mayor fluorescencia de fondo que en (A). La localización intracelular de Vkg-GFP (verde) parece tenue y menos definida (comparar B con A). (C) Imagen sobreprocesada que da como resultado una imagen donde la localización intracelular de Vkg-GFP aparece pixelada y granulada. Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Proyección ortogonal de una pila z adquirida y procesada utilizando enfoques de microscopía confocal y de superresolución. (A-B) Proyección ortogonal de secciones Z ópticas a través de una cámara de huevos que expresa Vkg-GFP (verde) y teñida para ADN (azul) y F-Actina (rojo) utilizando microscopía confocal (A) o superresolución (B). (A) Proyección de una pila z adquirida utilizando parámetros confocales óptimos. La localización intracelular de Vkg-GFP se puede observar en todo el eje z en los FC (A', flechas). El BM también es visible y parece muy brillante (A', puntas de flecha). (B) Proyección de una pila z adquirida mediante un procesamiento óptimo de superresolución. Se pueden observar compartimentos intracelulares bien definidos y vesículas que contienen Vkg-GFP en todo el eje z en las FC (B', flechas). El BM también está muy bien definido (B', puntas de flecha). La diferencia entre las imágenes confocales estándar y las imágenes de superresolución es evidente, ya que la localización intracelular de Vkg-GFP y la BM están significativamente más definidas cuando se usa la superresolución que la microscopía confocal estándar. Además, la imagen tomada por microscopía confocal tiene mayor fluorescencia de fondo. Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Reconstrucción 3D de una pila z adquirida y procesada utilizando enfoques de microscopía confocal y de superresolución. (A-B) Representación 3D de pilas z (vista mixta) de cámaras de huevos que expresan Vkg-GFP (verde) y se tiñen para ADN (azul) y F-actina (rojo). (A) Representación 3D de una pila z adquirida mediante microscopía confocal. La ubicación y la forma de los compartimentos y vesículas que contienen Vkg-GFP se pueden ver en todas las células (A'). (B) Representación 3D de una pila z adquirida a través de un procesamiento óptimo de superresolución. Se puede ver la ubicación y forma de los compartimentos y vesículas que contienen Vkg-GFP (B'). La forma de las vesículas, así como el BM y los núcleos, están suavemente definidos, y la resolución es mayor en comparación con la de la microscopía confocal (comparación con B' y A'). La forma y el tamaño de los compartimentos y vesículas que contienen Vkg-GFP también se pueden determinar mejor utilizando microscopía de superresolución (comparación con B' y A'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Caracterización de la localización de Vkg-GFP en Crag derribó FCs. (A-B) Sección longitudinal a través de una cámara de huevo que expresa Vkg-GFP (verde), teñida para ADN (azul) y F-Actina (rojo) y adquirida a través de un procesamiento óptimo de superresolución. (A) Línea de control que expresa crag de tipo salvaje, una proteína crítica para la deposición adecuada de BM. La FE muestra la localización típica de la proteína BM, en la que Vkg-GFP se distribuye intracelularmente y se deposita basalmente en la FE (A'). (B) Línea Drosophila transgénica que expresa RNAi para Crag en el FE, lo que resulta en un derribo de Crag. La pérdida de Crag conduce a la localización errónea de las proteínas BM (por ejemplo, Vkg-GFP) apicalmente en el FE (B', flechas y puntas de flecha). La imagen de superresolución se utiliza para caracterizar los fenotipos de localización errónea de BM asociados con la pérdida de Crag. Específicamente, algunos CRAG RNAi FCs, muestran una fuerte deslocalización apical de las proteínas BM (B', puntas de flecha), mientras que otros Crag RNAi FCs presentan una deslocalización apical más débil (B', flechas). Las imágenes de superresolución revelan claramente los fenotipos asociados con la pérdida de Crag (B', puntas de flecha vs flechas). Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Colocalización de Vkg-GFP y GM-130 (marcador de Golgi) utilizando enfoques de microscopía confocal y de superresolución. (A-D) Secciones longitudinales a través de cámaras de óvulos que expresan Vkg-GFP e inmunoteñidas para un marcador cis-Golgi (GM-130, rojo), fotografiado mediante microscopía confocal (A, B) o de superresolución (C, D). (A,B) Las imágenes confocales muestran que el Vkg-GFP intracelular se coloca parcialmente con un marcador cis-Golgi (A, punta de flecha). (B) Área ampliada de (A). Las distribuciones de píxeles verdes (Vkg-GFP) y rojos (GM-130) a lo largo de la flecha blanca se trazan en un histograma (B'). El eje x del histograma representa la distancia (μm) a lo largo de la flecha, mientras que el eje y representa la intensidad de los píxeles. Los picos verdes y rojos superpuestos (*) muestran dónde se colocalizan Vkg-GFP y GM-130. (C,D) Las imágenes de superresolución también muestran que el Vkg-GFP intracelular se coloca parcialmente con un marcador cis-Golgi (C, punta de flecha). (D) Área ampliada de (C). Las distribuciones de píxeles verdes (Vkg-GFP) y rojos (GM-130) a lo largo de la flecha blanca se trazan en un histograma (D'). El eje x del histograma representa la distancia (μm) a lo largo de la flecha, mientras que el eje y representa la intensidad de los píxeles. Los picos verdes y rojos superpuestos (*) muestran dónde se colocalizan Vkg-GFP y GM-130. Estos datos muestran que las imágenes de superresolución son un enfoque más eficiente y preciso que las imágenes confocales para caracterizar y cuantificar la colocalización. Barras de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros de adquisición y procesamiento de microscopía confocal y de superresolución para las imágenes representativas. Todos los parámetros de imagen principales se compilan para las imágenes representativas proporcionadas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

El BM es crítico para la morfogénesis embrionaria y de órganos, y las funciones fisiológicas adultas. Además, el BM actúa como plataforma de señalización para el establecimiento y mantenimiento de la polaridad epitelial y proporciona soporte a los tejidos². Sin embargo, los mecanismos que regulan la colocación adecuada de las proteínas BM son poco conocidos. Una mejor comprensión de las vías biológicas dedicadas al tráfico intracelular y la secreción polarizada de las proteínas BM requiere un análisis cuidadoso de los componentes de estas vías y sus funciones en el procesamiento de BM. Una forma de lograr esto es usar imágenes confocales y de superresolución. Aquí, describimos métodos para la preparación y tinción o inmunotinción de ovarios de Drosophila para obtener imágenes eficientes del tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en la FE utilizando microscopía confocal y de superresolución.

Ventajas de las proteínas trampa y las proteínas marcadas endógenamente para visualizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en condiciones de tipo salvaje y mutante
El protocolo proporcionado aprovecha al máximo las trampas de proteínas y las proteínas BM marcadas endógenamente (por ejemplo, Vkg-GFP y Pcan-GFP) para obtener imágenes y evaluar la localización y distribución de proteínas BM en el FE en condiciones de tipo salvaje (control) y mutantes. Estas líneas tienen importantes ventajas sobre el uso de anticuerpos contra las proteínas BM. En primer lugar, los anticuerpos contra proteínas específicas de interés son a menudo raros y en baja abundancia. Además, a menudo hay problemas con la penetrancia tisular asociada con anticuerpos que pueden conducir a una observación y evaluación inexactas de la proteína de interés. Además, las líneas trampa de proteínas se pueden insertar en diferentes antecedentes genéticos utilizados para determinar las funciones de los factores necesarios para la deposición adecuada del BM, como (i) métodos para manipular la expresión génica (por ejemplo, UAS / Gal4), (ii) mutantes y (iii) líneas de interferencia de ARN (RNAi). Finalmente, estas trampas de proteínas se pueden utilizar para visualizar la localización y la función de BM utilizando imágenes en vivo⁵⁷.

Sin embargo, la fusión de una etiqueta fluorescente a una proteína de interés puede interferir con su localización y funciones. Por lo tanto, es fundamental evaluar cualquier efecto aberrante de la etiqueta en la proteína. Una forma de garantizar que la adición de una etiqueta fluorescente no interfiera con la función y localización de las proteínas BM es determinar si la línea Drosophila transgénica es homocigota viable. Tanto las líneas Vkg-GFP como Pcan-GFP que se utilizan en los diferentes experimentos descritos aquí y anteriormente, son homocigotas viables, lo que indica que la adición de una etiqueta GFP no interfiere con la función de estas proteínas esenciales^29,30.

Importancia de la preparación, fijación y tinción de tejidos para la obtención de imágenes
Para obtener imágenes eficientes y precisas de la FE, es fundamental preparar, fijar y teñir el tejido ovárico correctamente según las indicaciones de este método. Primero, después de la disección, retire cuidadosamente todos los demás órganos y los restos de mosca antes de la fijación. Se recomienda el uso de paraformaldehído (PFA) para fijar el tejido, ya que conduce a una fluorescencia GFP brillante y es compatible con la mayoría de los anticuerpos. Sin embargo, el PFA puede no ser compatible con todos los anticuerpos; algunos pueden requerir fijación de glutaraldehído o metanol. Además, para evitar la fluorescencia de fondo debido a la unión inespecífica del anticuerpo primario, el tejido ovárico debe incubarse en un balancín de plataforma nutating durante al menos 1 h en solución de bloqueo, y lavarse ampliamente varias veces después de la incubación primaria y secundaria de anticuerpos como se describe en el protocolo. Finalmente, el montaje adecuado del tejido ovárico es esencial para lograr una imagen óptima. Esto requiere una separación cuidadosa de las cámaras de huevos individuales para evitar que se apilen una encima de la otra. También es importante dejar que el medio de montaje se polimerice completamente antes de la obtención de imágenes para evitar que flote el tejido debajo de la cubierta. Esto permite además que el medio de montaje alcance su índice reflectante óptimo, lo cual es muy importante para las imágenes de superresolución. Si no lo hace, afectará a la calidad de la imagen. Además, las diapositivas preparadas se pueden almacenar hasta 1 mes a 4 ° C, antes de que se apague la fluorescencia. Además del protocolo proporcionado, hay varios otros protocolos disponibles para la disección ovárica y la tinción 53,54,55.

El uso de parámetros adecuados de adquisición y procesamiento es fundamental para obtener imágenes óptimas y evaluar la localización de proteínas BM utilizando imágenes confocales y de superresolución.
Como se describió anteriormente, es fundamental establecer correctamente los parámetros de adquisición para imágenes confocales y de superresolución para obtener imágenes óptimas de la muestra. Para la adquisición de imágenes, el ROI debe seleccionarse cuidadosamente utilizando la función de zoom y, a continuación, establecer el tamaño del fotograma y la velocidad de adquisición de forma óptima. Además, como se ilustra en la Figura 2, es fundamental ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector adecuadamente para visualizar el tráfico intracelular sin saturar los detectores. Estos parámetros deben establecerse con mucho cuidado para evitar imágenes subexpuestas o sobreexpuestas (Figura 2). Las imágenes subexpuestas darán lugar a imágenes de baja resolución, en las que las estructuras intracelulares serán difíciles de visualizar y caracterizar (Figura 2B). Las imágenes sobreexpuestas debido a la saturación del detector conducen a una mala interpretación de los datos y a artefactos de colocalización (Figura 2C). Si el objetivo es determinar la localización vesicular de proteínas BM marcadas endógenamente, la fluorescencia de las proteínas marcadas con GFP (por ejemplo, Vkg-GFP y Pcan-GFP) en la BM basal satura rápidamente el detector. Sin embargo, las vesículas que contienen menos proteínas BM marcadas con GFP aparecerán tenues. Por lo tanto, es importante establecer la sensibilidad de la imagen utilizando las estructuras intracelulares que contienen BM (por ejemplo, vesículas), y no en la BM (Figura 2). Seleccionar el tamaño del agujero de alfiler también es muy importante. Idealmente, se debe seleccionar un tamaño estenopeico de 1 UA para cada canal para obtener imágenes de la mejor calidad, especialmente cuando la resolución en el eje Z es importante. El tamaño de agujero de alfiler más pequeño es óptimo para secciones ópticas más delgadas. Sin embargo, cuando no se requiere una resolución óptima del eje Z o no se está capturando una pila z, se puede aumentar el tamaño del agujero de alfiler para evitar el fotoblanqueo. Además, para señales muy tenues, aumentar el tamaño del agujero de alfiler puede ayudar debido a una mayor relación señal-ruido y la captura de más fotones, lo que ayuda en la interpretación de datos.

Para las imágenes de superresolución, se debe prestar especial atención al procesamiento de deconvolución para evitar generar imágenes poco procesadas o sobreprocesadas que están mal resueltas, como se ilustra en la Figura 3. Finalmente, para lograr una reconstrucción 3D óptima, se recomienda encarecidamente establecer el mejor intervalo determinado por el software. Un intervalo demasiado grande entre las secciones z (es decir, superior a 0,5 μm) conducirá a una representación 3D deficiente y afectará el análisis posterior del fenotipo.

Ventaja de la superresolución sobre la microscopía confocal tradicional al obtener imágenes del tráfico intracelular BM
Como se ilustra en la sección de resultados, aunque la localización y distribución de las proteínas BM se puede evaluar con precisión utilizando imágenes confocales, el enfoque de superresolución descrito genera datos de imagen más precisos con un aumento significativo en la resolución de las estructuras intracelulares que contienen proteínas BM, así como una relación señal-ruido mejorada. Además, esta técnica de microscopía de superresolución es relativamente fácil de usar. Dado que las imágenes de superresolución aumentan significativamente la resolución en comparación con la microscopía confocal, hasta 120 nm en los ejes x e y y 350 nm en el eje z, este enfoque tendrá un gran impacto en nuestra comprensión de la deposición polarizada de BM al caracterizar con mayor precisión el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en células epiteliales como las FC.

Además, otro enfoque de imagen de superresolución (Microscopía de Iluminación Estructurada, SIM) y el uso de algoritmos de deconvolución diseñados para la microscopía confocal de escaneo puntual (es decir, el módulo de software de resolución mejorada de Nikon) se han utilizado anteriormente para caracterizar el papel de los factores involucrados en la deposición BM²⁹. El aumento de la resolución asociada con estas técnicas ha proporcionado información clave sobre nuestra comprensión del tráfico intracelular de proteínas BM y la organización de las BM. Sin embargo, estos enfoques presentan algunas limitaciones en comparación con la microscopía Airyscan. Por ejemplo, la SIM no es muy eficiente en la adquisición de imágenes óptimas al obtener secciones Z ópticas profundas en el tejido. Esto hace que la SIM sea difícil de usar cuando se buscan nuevos componentes involucrados en la deposición de BM. Además, el uso de algoritmos de deconvolución aplicados a imágenes confocales no alcanza el mismo nivel de superresolución. En general, las imágenes de superresolución de Airyscan en tejido fijo son un enfoque poderoso y superior para estudiar el tráfico intracelular de BM y la deposición.

Sin embargo, al igual que con cualquier otra microscopía de superresolución, algunos inconvenientes también están asociados con este enfoque, y deben tenerse en cuenta al tomar imágenes. En primer lugar, el modo de superresolución generalmente requiere un tiempo de adquisición más largo de la muestra que el modo confocal. Por lo tanto, los parámetros de adquisición y la región de interés deben establecerse cuidadosamente para minimizar el fotoblanqueo de la muestra. Además, los archivos de imagen generados por microscopía de superresolución son mucho más grandes que los archivos generados por microscopía confocal y pueden necesitar computadoras o servidores especializados para el procesamiento y almacenamiento de imágenes.

Finalmente, se han utilizado imágenes en vivo de las proteínas BM durante la oogénesis de Drosophila para caracterizar nuevos factores involucrados en la polaridad BM⁵⁷. Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones, específicamente en la resolución de estructuras intracelulares durante el tráfico de proteínas BM. La microscopía de superresolución es un enfoque poderoso para usar junto con imágenes en vivo para determinar con precisión el papel de los factores identificados en la deposición polarizada de proteínas BM.

Otras aplicaciones de este método para estudiar la localización de componentes intracelulares dedicados al tráfico vesicular utilizando proteínas marcadas endógenamente e imágenes de superresolución
El establecimiento y mantenimiento de tejidos y órganos durante el desarrollo y en un organismo adulto dependen en parte de la señalización de célula a célula y de la tensión y adhesión celular. Estos procesos dependen del tráfico intracelular, la endocitosis, la exocitosis y la secreción de proteínas específicas. Así, los métodos aquí descritos para descifrar el tráfico intracelular de BM utilizando proteínas marcadas endógenamente y microscopía confocal y de superresolución podrían adaptarse fácilmente para estudiar cada proceso. Además, la facilidad de uso de la edición genética mediada por CRISPR/Cas9 para generar proteínas marcadas endógenamente hace que este enfoque sea aún más versátil y potente⁵⁸.

En conclusión, hemos descrito métodos para la preparación e imagen de proteínas BM en la FE del ovario de Drosophila mediante microscopía confocal y de superresolución. Estos protocolos se pueden aplicar para el cribado de alto rendimiento para identificar nuevos componentes dedicados a la colocación adecuada de las proteínas BM. Finalmente, el empleo de esta metodología tiene el potencial de hacer contribuciones significativas a nuestra comprensión de cómo las células epiteliales controlan la secreción polarizada de proteínas BM, un proceso clave en el establecimiento y mantenimiento de la arquitectura epitelial.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing