Summary
基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。
Abstract
基底膜(BM)は、上皮細胞の基底側に存在する細胞外マトリックスの特殊なシートであり、上皮組織の形態および器官形態形成の確立および維持に重要である。さらに、BMは組織モデリングに不可欠であり、シグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織および器官を形成するための外力を提供する。正常な発達および病理学的状態においてBMが果たす多くの重要な役割にもかかわらず、BM含有小胞の細胞内輸送を制御する生物学的経路および基礎分泌がBMタンパク質の分極沈着にどのようにつながるかはほとんど理解されていない。 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮は、BMのすべての主要成分を産生および分泌するため、BM膜タンパク質の基礎沈着を研究するための優れたモデルシステムです。この記事では、 ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮に内因的にタグ付けされたタンパク質を使用して、BM含有小胞および沈着BMを染色およびイメージングするための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、定性的および定量的問題の両方に対処するために適用することができ、ハイスループットスクリーニングに対応するために開発され、上皮組織発達中の分極細胞内輸送および小胞の分泌に関与する因子の迅速かつ効率的な同定を可能にする。
Introduction
基底膜(BM)は、上皮構造および形態形成に重要な層状細胞付着性細胞外マトリックス(ECM)の薄いシートである1。それは〜50のタンパク質を含み、上皮および内皮細胞の根底にある遍在的に見出され、そして骨格、平滑、および心筋細胞および脂肪細胞を包み込む1,2,3。上皮細胞の基底側にあるBMの3つの主要成分は、コラーゲンIV、ペルレカン、およびラミニンである。BMは上皮細胞の根底にあり、組織の分離と障壁、成長と支持、細胞分極2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12を含む多くの機能を担当しています。.シグナル伝達プラットフォームとしてのその役割は、発生中の上皮細胞および組織の形態および分化を調節する3、13、14。さらに、BMの誤った調節および/またはその完全性の侵害は、腫瘍転移を含む多くの病理学的状態の主な原因である2,15,16。組織および器官の形態形成中にBMによって実行される本質的な機能にもかかわらず、BMタンパク質の分極細胞内輸送および分泌に捧げられた生物学的経路の構成要素は漠然と知られている。
BM含有小胞の細胞内輸送および上皮細胞によるBMタンパク質の分泌を研究するために、ショウジョウバエ卵巣の濾胞上皮(FE)は強力なモデル系である(図1)。ショウジョウバエの卵巣は、卵巣と呼ばれる16〜20個の長い管状の構造を含む(図1A、B)17、18、19。各卵巣は卵組立ラインと考えることができ、成熟した卵が卵管を通って出るまで、前端から始まり後方に移動する卵室(それぞれが卵を生じる)の年齢進行を伴う。各卵室は、中央生殖細胞系列細胞(GC)を囲む体細胞卵胞細胞(FC)の単層であるFEによってカプセル化されている。FEは、頂端ドメインが生殖細胞系列に面し、BMタンパク質が基底的に分泌される明確な頂端 - 基底極性で高度に分極している18,19。FCは、コラーゲンIV、ペルレカン、ラミニン20,21を含むBMの主要成分のすべてを積極的に分泌します。FCなどの上皮細胞では、BM成分が産生され、細胞外に沈着するために特殊な分極分泌経路を必要とする。例えば、BMの最も豊富な成分であるコラーゲンIV(Coll IV)の場合、その産生および沈着が多くの研究の焦点であるにもかかわらず、その分極した細胞内輸送および分泌を取り巻く詳細は曖昧である。コルIVは小胞体(ER)に翻訳され、ここでも各線維−3つのポリペプチド(2つのα1鎖および1つのα2鎖)からなる−が三重らせん22に組み立てられる。適切なコルIVの折り畳みおよび機能には、PlodおよびPH4αEFB20、22、23、24、25、26などのリジルおよびプロリルヒドロキシラーゼを含むERシャペロンおよび酵素が必要である。これらの翻訳後酵素は、それぞれの喪失がコルIVを基底ER 20、23、24、25、26に捕捉させるので、コルIVのER選別を調節する。次いで、新たに合成されたコルIVは、COPII被覆小胞においてゴルジ体に対するERを出る。貨物受容体Tango1は、コラーゲンを大きな多量体タンパク質を収容できる大きなゴルジ結合小胞に包装するのに役立ちます20,27。Coll IVが細胞内外膠細胞小胞にパッケージ化されると、上皮細胞から基底的に特異的に分泌される。BM沈着を基底側に向けるために、上皮細胞は、偏光BM分泌に特異的に捧げられた別の因子セットを必要とする。ショウジョウバエ卵巣のFEを用いて、ヌクレオチド交換因子(GEF)CragおよびStratum、GTPaseRab8およびRab10、ならびにホスホイノシチドPI(4,5)P2、ならびにキネシン1および3モータータンパク質20、28、29、30、31のレベルを含む、この新規な細胞プロセスのいくつかの成分が特徴付けられている20、28、29、30、31.これらの成分は、BMタンパク質の偏光分布を確実にする上で重要である。
FEにおけるBMタンパク質の細胞内局在をモニターするために、内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質(タンパク質トラップ)、例えばバイキング−GFP(Vkg−GFPまたはα2コールIV−GFP)およびペルレカン−GFP(Pcan−GFP)32、33を使用することができる。これらのタンパク質トラップラインは、BMタンパク質の内因性分布を正確に反映し、小胞トラフィッキングのより高感度な検出を可能にすることが示されている28,30。FEにおけるBMの偏光沈着に関与する成分は、Vkg−GFPおよびPcan−GFP20、28、29、30についてのタンパク質トラップラインを用いて最初に特徴付けられた。タンパク質トラップは、変異体およびGal4系統34を含む異なる遺伝的背景において使用することができる。さらに、タンパク質トラップを蛍光色素および/または蛍光免疫染色と組み合わせて使用することができ、野生型および変異型条件を比較する際にBMタンパク質の局在の正確な特性評価を可能にする35。
BMタンパク質含有小胞の分布および局在を正確かつ効率的に評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)および超解像イメージング技術は、他のイメージングアプローチに大きな利点を提示する。これらのアプローチは、高解像度イメージングと比較的使いやすさを兼ね備えています。CLSMは、ガルバノメータを使用してラスタースキャン方式で試料をレーザーでスキャンすることにより、光学分解能を向上させる顕微鏡技術です。ピンホール開口部は、共焦点顕微鏡のコアコンポーネントです。焦点面の上または下から来る焦点ずれ信号を遮断することによって、ピンホール開口部は、z軸36において非常に優れた分解能をもたらす。これはまた、一連の光学セクションに対応するzスタックと呼ばれるz平面内の一連の画像を得ることを可能にする。zスタックはその後、イメージングソフトウェアの助けを借りて、3D再構成を介して標本の3D画像を作成します。従来の落射蛍光(広視野)顕微鏡は、共焦点顕微鏡とは異なり、焦点の合わない光が画質に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させる36,37。これにより、落射蛍光顕微鏡は、タンパク質の局在化または共局在を研究する際の魅力の低い候補になります。
CLSMは、BMタンパク質の細胞内輸送のイメージングや特性評価など、さまざまなアプリケーションに適したアプローチですが、アッベの回折限界(200-250nm)未満のサンプルをイメージングする場合、依然として問題となります。このようなサンプルを画像化する場合、共焦点顕微鏡は、特にオイル対物レンズを使用する場合、高解像度をもたらし得る。しかし、超解像技術は共焦点顕微鏡の限界を超えています。超解像顕微鏡法を実現するにはさまざまなアプローチがあり、それぞれに特定の分解能限界があり、それぞれが異なる分析に適しています。これらのアプローチには、光活性化局在化顕微鏡(PALM)または確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、誘導放出枯渇顕微鏡(STED)、構造化照明顕微鏡(SIM)、およびエアリスキャン(超解像)顕微鏡38、39、40、41、42、43、44、45、46が含まれる。.Airyscanの解像度はPALM/STORM、STED、SIMよりも粗いですが、最大120nm(CLSMの約2倍の解像度)の解像度を達成できます。さらに、この超解像顕微鏡アプローチは、厚いサンプルおよび低い信号対雑音比のサンプルをイメージングする際に、SIMおよび他の超解像技術よりも有利であることが示されている47,48。
Airyscanは、比較的新しい超解像共焦点顕微鏡技術46である。ピンホール検出器とシングルポイント検出器を使用して焦点の合っていない光を除去する従来のCLSMとは異なり、この超解像アプローチは、すべてのスキャン位置45ですべての光を収集する32チャンネルガリウム砒素リン化物(GaAsP)光電子増倍管面積検出器を使用します。32個の検出器のそれぞれは小さなピンホールとして機能し、ピンホールのサイズを従来の1.0エアリーユニット(A.U.)から強化された0.2A.U.に縮小し、直径1.25A.U.の効率を維持しながら、さらに高い分解能と信号対雑音比を可能にします45。さらに、Airyscanで使用される線形デコンボリューションは、分解能45を最大2倍増加させます。これを考慮に入れると、CLSM、特に超解像顕微鏡は、局在化および共局在研究のための非常に高い解像度の画像を生成することができるため、BMタンパク質およびBMタンパク質の基礎沈着を調節するタンパク質の研究に適しており、それによってこれらのプロセスを制御する空間的、時間的、および分子的事象に新しい洞察を提供する。
局在化実験の実行に使用できる共焦点顕微鏡の代替アプローチは、画像デコンボリューションである。広視野顕微鏡は、焦点の合っていない光が検出器に到達することを可能にするので、広視野顕微鏡によって得られた画像から焦点の合っていない光を除去または再割り当てするために、数学的および計算的デコンボリューションアルゴリズムを適用することができ、それによって、画像49の解像度およびコントラストを改善することができる。デコンボリューションアルゴリズムは、共焦点画像にも適用して、解像度およびコントラストをさらに高め、超解像顕微鏡50のそれにほぼ匹敵する最終画像を生成することができる。Airyscanは、シェパードのピクセル再割り当てとともにワイナーフィルタベースのデコンボリューションを利用し、空間分解能と信号対雑音比を大幅に改善します。共焦点顕微鏡と比較して、この超解像顕微鏡技術を使用すると、3つの空間寸法(xおよびyで120nm、zで350nm)すべてで分解能が2倍の増加が観察される45,51。
この原稿は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEを共焦点および超解像顕微鏡と組み合わせたモデルシステムとして使用して、BMタンパク質の細胞内輸送および沈着を染色、取得、および視覚化するための詳細かつ最適化されたプロトコルを提供する。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質、例えばVkg−GFPおよびPcan−GFPを発現する ショウジョウバエ 系統は、BMタンパク質の輸送および分泌を視覚化するための効率的かつ正確なツールである。さらに、それらは、突然変異体および Gal4/UAS 系統34を含む異なる遺伝的背景において容易に使用することができる。内因的にタグ付けされた基底膜タンパク質が推奨されるが、特定のBMタンパク質に対する抗体の使用もまた、記載されたプロトコールと適合性がある。これらのプロトコルは、共焦点および超解像イメージングを使用して、細胞内輸送および無傷の上皮組織におけるBMタンパク質の分泌を研究することに関心のある科学者にとって特に有用である。さらに、上皮組織分析と ショウジョウバエ 遺伝学の広範なツールを組み合わせる能力は、このアプローチを特に強力にします。最後に、これらのプロトコルは、水疱輸送および関心のある他のタンパク質の選別を研究するために容易に適合させることができる。
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Protocol
1.卵巣解剖のためのハエの準備
- 25°Cでの解剖の2〜3日前に少量の粒状パン酵母を振りかけた〜8mLのショウジョウバエ培地を含む狭いバイアルに、所望の遺伝子型の10〜15匹のショウジョウバエメラノガスター雌ハエ(1〜2日齢)を入れる。 バイアルに数人の男性を加えると、卵室の収量を増やすことができます。ただし、ハエの総数が20を超えないようにしてください。
注:ショウジョウバエの男性と女性の説明、およびショウジョウバエの経験のない科学者のための有用なヒントとアドバイスは、引用された記事34,52で見つけることができます。酵母を添加すると、産卵が刺激され、異なる段階で表される卵巣が生成されます。さらに、それはまた卵巣を太らせ、それらを切除しやすくします。粒状酵母の代わりに湿った酵母を使用することもできますが、弱い株の場合、ハエは立ち往生して死ぬことがあります。
2.卵巣の解剖と固定
注:卵巣の解剖および染色に関するその他のリソースについては、読者は引用されたプロトコル53、54、55に誘導されます。
- 解剖当日、PFA原液を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して終濃度4%のパラホルムアルデヒド(PFA)の新鮮な固定液を調製する。
- CO2を使用してハエを麻酔し、フライパッドの上に置きます。ハエを解剖するまで麻酔をかけたままにしておきます。ハエの動きが止まったら、通常は10〜20秒かかるので、適切に麻酔をかけてください。
注:より安全で迅速な選択肢としてCO2 を使用することが推奨されますが、ハエは氷を使用して麻酔をかけることができます。 - ガラス凹状のスライドまたは浅いくぼみのある染色皿を解剖顕微鏡の下に置き、ウェルを1x PBSで満たします。
- 一対の鉗子を使用して、胸郭下部で雌のハエをつかむ。二次的特徴として、腹部の後端に男性性器がなく、前足に性櫛がないことによって、ハエの性別を確保する52。別のペアの鉗子を使用して個別にハエを解剖し(ステップ2.5)、解剖顕微鏡下で1x PBSで満たされたウェルにそれらを沈めます(20倍の倍率を推奨)。
- 解剖顕微鏡を覗き込みながら、別の鉗子を使ってハエの腹部の後部を引っ張り、内臓(卵巣、腸など)を見えるようにします。
- フライ腹部の前部を優しく絞って(歯磨き粉のチューブのように)、卵巣を腹部から押し出します。この方法は卵巣を無傷に保つべきです。他の臓器を取り外して慎重に取り除き、破片を飛ばします。
- 鉗子または切除針を使用して、卵巣全体の構造をそのまま保ちながら、卵巣の卵巣を分離します。このステップの目的は、卵巣を覆っている筋肉鞘を壊し、より効率的で均質な染色を可能にすることです。
- 卵巣を1x PBSを含む1.5 mLの微量遠心チューブに素早く移し、すべてのハエが解剖されるまでチューブを氷上に保ちます。微小管またはマイクロフィラメント(またはこれらの細胞骨格成分によって輸送される小胞)を視覚化する場合は、解重合を引き起こす可能性があるため、チューブを氷上に保たないでください。
- すべての卵巣を解剖して微量遠心チューブに移したら、卵巣をチューブの底に沈め、〜50μL以外のPBSをすべて取り除きます。1mLの4%PFAを加え、ナットプラットフォームロッカーに15分間置きます。重要なのは、不完全な固定が染色やイメージングの問題につながる可能性があるため、卵巣が固定溶液内で前後に動いているかどうかを確認することです。
メモ: ヌータの速度は重要ではありません。一部のヌーテーターには速度制御機能がありますが、他のナットーターにはプリセット速度が付属しています。プリセット速度は十分であり、調整可能な場合は40〜50rpmに設定します。 - 固定溶液を取り出し(ステップ2.9のように)、マイクロフュージチューブを5〜6回静かに反転させることにより、0.1%Triton-X 100(1x PBST)を含む1mLの1x PBSで2回のクイック洗浄を行う。その後、1mLの1x PBST(合計40〜60分)で4回の10〜15分の洗浄(ロングウォッシュ)を続行します。
注:洗剤の割合を増やすとGFP変性が生じ、GFPタグ付きBMタンパク質の蛍光および検出が低下する可能性があるため、洗浄には1x PBS + 0.1% Triton-X 100を使用することをお勧めします。 - 色素染色、例えばDNA染色およびF-アクチン染色については、ステップ3に進む。免疫染色の場合は、手順 4 に進みます。卵巣は、続行する前に4°Cで最大24時間1x PBSTに保存することができます。
3. 標準的なDNA/Fアクチン染色
- 固定および洗浄後、PBSTを除去する。500 μLのDNAおよびF-アクチン染色液を加える。DNA/F-アクチン溶液を調製するには、ヘキスト(DNA染色液;1mg/mLストック溶液の1:1000希釈)とフルオロフォアタグ付きファロイジン(F-アクチン染色;Alexa Fluor 546の場合は1:500希釈、またはAlexa Fluor 647の場合は1:100希釈、それぞれ66μMのストック溶液)を500μLのPBSTに混合します。
- チューブをアルミホイルで覆い、卵巣と染料を暗闇に保ち、蛍光を維持して効率的なイメージングを行い、ナットプラットフォームロッカーで15分間インキュベートします。
- インキュベーション後、DNA/F-Actin溶液を除去します(ステップ2.9のように)。ステップ 2.10 で説明したように、2 回のクイック洗浄と 3 回の長時間 (10 ~ 15 分) 洗浄を 1x PBST で実行します。手順 5 の説明に従って取り付けに進みます。
4. 蛍光免疫染色
注:これは蛍光イメージング用の標準的な免疫染色プロトコルであり、ほとんどの一次抗体と互換性があります。
- ブロッキングおよび一次抗体免疫染色(1日目)
- 固定および洗浄後、ステップ2.9で説明したようにPBSTを除去する。1mLのブロッキング溶液(PBS + 5% BSA)を加え、栄養プラットフォームロッカーで卵巣を最低1時間ブロックします。
注:BSAに加えて、ウシ胎児血清(FBS)または正常ヤギ血清(NGS)をブロッキング溶液に添加することができる。あるいは、卵巣を4°Cのナットプラットフォームロッカーで一晩ブロックすることができます。 - 工程2.9と同様にブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中に適切な濃度(使用する抗体に特異的)に希釈した一次抗体を含む一次抗体溶液を300μL加える。4°Cのナットプラットフォームロッカーで一晩インキュベートします。 翌日、一次抗体溶液を取り出し、二次抗体免疫染色に進む。
注:一部の一次抗体は保存して再利用することができます。場合によっては、一次抗体を再利用するとバックグラウンド染色が減少し、より良いイメージングが得られます。ただし、効率を確保するために、各抗体について再利用をテストする必要があります。
- 固定および洗浄後、ステップ2.9で説明したようにPBSTを除去する。1mLのブロッキング溶液(PBS + 5% BSA)を加え、栄養プラットフォームロッカーで卵巣を最低1時間ブロックします。
- 二次抗体免疫染色(2日目)
- 一次抗体溶液を除去した後、ステップ2.10のように、2回のクイック洗浄および4回の長い(10〜15分)洗浄を行う。新鮮な1x PBSTを使用して慎重に反復洗浄を行うと、非特異的なバックグラウンドが減少し、最適なイメージングにつながります。
- ステップ2.9のようにPBSTを除去し、使用した一次抗体を検出する蛍光二次抗体を含む二次抗体溶液を500μL加える。画像の取得と解析に不可欠な蛍光の最適な保存のために、この時点からチューブをアルミ箔で覆って光から保護します。
注:二次抗体溶液には、内因的にタグ付けされたタンパク質と重複しない蛍光色素を結合させた二次抗体が含まれている必要があります。例えば、GFPタグ付きタンパク質を使用する場合、赤色または遠赤色の波長(例えば、546、568、または647nm)でのAlexa Fluor二次抗体の使用が推奨される。ヘキストおよびAlexa Fluor 546または647コンジュゲートファロイジンなどの蛍光色素を、二次溶液に添加することができる。これらの染色は、細胞構造全体(すなわち、核およびF-アクチン)をマークするのに有用であり得る。濃度については、ステップ 3.1 を参照してください。 - 二次抗体溶液中の卵巣を、ナットリングプラットフォームロッカー上で室温で2時間インキュベートする。ステップ 2.10 のように、1x PBST で 2 回のクイック洗浄と 4 回の長時間 (10 ~ 15 分) 洗浄を実行します。手順 5 のように取り付けに進みます。
5.染色卵巣の取り付け
注:この方法は、卵巣がよく発達していて豊富である場合に非常にうまく機能します。スライドに卵巣を慎重に取り付けることは、最適なイメージングのために重要です。
- 最後の洗浄後、p1000ピペットを使用して卵巣をチューブ内で上下に静かにピペッティングし、卵室を分離します。チューブを5〜10分間直立させたままにして、卵室を底に沈ませます。個々の卵室を慎重に分離することは、最適な画像取得を達成するために重要です。
- パスツールピペットを使用してPBSTを除去し、約50μLを残します。p200ピペットを使用して、残りのPBSTをできるだけ多く取り除きます。22 mm x 22 mm のカバースリップに均等に広がるのに十分な取り付け用媒体を 2 滴加えます。卵巣は、取り付け前に最大1ヶ月間、4°Cの微量遠心チューブ内の取り付け媒体に保存することができます。
メモ: いくつかの異なるマウントメディアが市販されています。最適なイメージング条件を達成するために、アクアポリ/マウントやProLongガラス退色防止マウンタントなどのハードセッティングマウント剤を使用することをお勧めします。グリセロールをマウント媒体として使用することは、劣悪なイメージング条件(例えば、蛍光色素分子の不安定性)につながる可能性があるため、推奨されません。重合しない取り付け媒体の場合は、カバースリップシーラント/マニキュアを使用してカバースリップをシールし、所定の位置に固定します。 - スライドガラスにラベルを付け、柔らかいほこりのない紙で拭いてほこりや指紋を取り除きます。p200ピペットチップの端を切り取り、粘性マウント媒体を微量遠心チューブからスライドに簡単に移動できるようにします。次に、取り付け媒体内のすべての卵室をスライドガラスにゆっくりと移し、気泡を発生させないようにします。
- 解剖顕微鏡下で、取り付け媒体を静かに広げ、カバースリップのほぼ大きさの領域をカバーするために、新しいp200先端または鉗子を使用して卵チャンバーを分離します。
- 鉗子を使用して、カバースリップ(ほこりのない紙できれいにした)を気泡を避けるために斜めに卵室に慎重に置きます。
- スライドを室温で暗所の平らな面に2日間保存し、重合させる。マウントメディアが硬化したら、スライドを4°Cの暗所で数週間保存してイメージングすることができます。
メモ:ハードセッティングのマウント媒体は、イメージング前に重合することが重要です。媒体がまだ重合していない場合、卵巣はカバースリップの下に浮遊し、画像取得に影響を与えます。さらに、マウントメディアの最適な反射率は、完全に設定した後にのみ達成されます(詳細については、製造元の情報を参照してください)。 - 代替取り付け方法:この方法は、卵巣が豊富でない場合の組織損失を減らすために推奨されます。この方法(後述)では、卵巣と卵室を、ステップ5.1で説明したピペッティングによって微量遠心管で分離するのではなく、取り付けながらスライド上に分離する。
- 最後の洗浄後、〜100μLの洗浄溶液を除くすべてを除去する。パスツールピペットまたはp1000ピペットを使用して、PBS中の無傷の卵巣をスライドに移す。p200ピペットを使用して、できるだけ多くのPBSTをスライドから慎重に取り外します。必要に応じて、ほこりのない紙を使用してPBSTを拭き取ります。卵巣に触れないでください。
- マウント メディアを 2 滴追加します。卵巣と卵室を鉗子または解剖針を使用して慎重に分離します。無関係な組織を除去して廃棄し、次いで卵室および卵巣を取り付け培地中に広げる。ステップ 5.5 から 5.6 に進みます。
6. 共焦点画像取得
メモ:このセクションでは、任意の共焦点顕微鏡を使用して最適な画像取得を実現するための重要なパラメータを提供します(図2)。
- 顕微鏡をセットアップし、以下のようにサンプルを見つけます。
- イメージングの前に、蛍光顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域(ROI)を特定することが重要です。低倍率の対物レンズ(20倍)または画像取得に使用する対物レンズ(40倍または63倍)を使用します。画像化する卵室を選択します。
メモ:画像の取得には、40倍や63倍などの高倍率の対物レンズを使用することをお勧めします(6.2.1を参照)。 - ROIが選択されたら、画像集録に進みます。共焦点イメージングの場合はステップ 6.2、超解像イメージングの場合はステップ 7 に進みます。
- イメージングの前に、蛍光顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域(ROI)を特定することが重要です。低倍率の対物レンズ(20倍)または画像取得に使用する対物レンズ(40倍または63倍)を使用します。画像化する卵室を選択します。
- 以下のようにして最適な画像取得のためのキーパラメータを選択します(代表画像のキーパラメータの例を 表1に示します)。
- 目的の選択:FE中のBMタンパク質の細胞内輸送および分泌の共焦点画像取得には、40倍または63倍の対物レンズを使用する。
メモ:可能な限り最高の解像度を達成するには、最高の無彩色補正を提供する高い開口数(NA)を備えたPlan-Apochromat目標を使用することを強くお勧めします。 - 各チャンネル/トラックのレーザーの選択:GFPの場合は、レーザー488nmを使用します。DAPIまたはヘキストの場合は、レーザー405nmを使用してください。Alexa Fluor 546または568の場合は、レーザー561nmを使用してください。Alexa Fluor 647の場合は、レーザー640nmを使用してください。
メモ:レーザーを選択するたびに、異なるチャンネル/トラック形成が行われます。ここで、チャネルという用語は、各チャネルの特定の波長で選択されたROIに対する励起蛍光色素について記録された強度分布によって形成される画像を指す。 - ピンホール設定:画像取得中にピントが合わない光を減らすには、各チャンネルのピンホールを 1 AU に設定します。
- レーザー強度と検出器ゲインの設定: 画像感度を微調整するには、検出器マスターゲインとレーザーパワーの両方を使用します。画像感度を正しく設定するには、範囲インジケータをお勧めします。マスターゲインとレーザーパワーの両方を、検出器の飽和を回避しながら、目的の構造(BM含有小胞など)がはっきりと見える適切な感度になるように設定します。
メモ:フォトブリーチングを避けるため、レーザー出力は必要最小限に抑えてください。可能な限り低いレーザー出力を使用しながら、最初に検出器のゲインを上げることをお勧めします。検出器のゲインの増加が所望の強度を達成できない場合は、レーザー出力を増加させます。レーザー出力強度は0.5%~1.2%を推奨します。 - フレームサイズ:集録ソフトウェアによって決定された最適な画像サイズを使用することをお勧めします。ほとんどのアプリケーションでは、1024 x 1024 の最大解像度を使用します。分解能が高いほど、集録時間が大幅に長くなります。
- スキャン速度: ほとんどのサンプルで安全な 6 ~ 9 のスキャン速度を使用します。サンプルにノイズが多くなる場合は、スキャン速度を遅くして信号対雑音比を改善します。ただし、スキャン速度が低いと、フォトブリーチングと取得時間が長くなります。
- 平均強度平均化: 画質を向上させるには、同じ設定で連続してスキャン して 平均強度平均化を使用します。ほとんどの場合、平均化を2にすると、サンプルをフォトブリーチングすることなく信号対雑音比が向上します。
- ズーム:ズーム機能を使用してスキャン領域を調整します。40倍と63倍の両方の対物レンズを最も効果的な値として2倍から4倍の間のズームを使用して、FE内のBM含有小胞を明確に視覚化します。最小ROIを慎重に選択して、集録時間を短縮します。
- 目的の選択:FE中のBMタンパク質の細胞内輸送および分泌の共焦点画像取得には、40倍または63倍の対物レンズを使用する。
- Zeiss Zenソフトウェアを使用してzスタックを取得するには、以下のZセクショニングパラメータを使用し、以下のように設定します。
注:BMタンパク質を含む小胞および他の細胞内構造は、3次元(3D)構造である。FEを介してzスタックを取得すると、画質と解像度が大幅に向上します。通常、組織の厚さ/深さにまたがる範囲は、細胞内局在化を効率的に視覚化するのに十分である。最適な3D再構成のためには、ソフトウェアによって決定される最適な間隔を使用することをお勧めします。目標 40 倍と 63 倍の場合、最適な 3D 再構成を可能にするために、各 Z 断面間の間隔が 0.5 μm を超える場合は避けてください。- 「取得」タブの下のメイン領域にある「z-Stack」チェックボックスをクリックします。Z スタックの「スライスあたりのすべてのトラック」スキャンモードを選択します。これにより、各 Z 位置スライスのチャンネルトラックが変更されます。
- 目的のチャンネルを選択して標本を観察し、 Live をクリックしてライブスキャンを開始します。GFPタグ付きBMタンパク質を検出するために必要なチャネルの使用が推奨される。
- 説明に従って z スタックの範囲を設定します。顕微鏡の微調整ノブを使用して、試料の一端のz位置を見つけ、「 最初に設定」をクリックします。同様に、標本のもう一方の端の Z 位置を見つけて、「 最後に設定」をクリックします。
- Zスタック内の各位置について、範囲インジケータを選択して各チャンネルを個別にクリックし、必要に応じてレーザーの強度とマスターゲインを調整します(手順6.2.4で説明)。
- zスタックの間隔を設定して、ステップ6.3の下のNOTEで推奨されているようにステップサイズを割り当てます。[ 実験の開始] をクリックして、Z スタックの取得を開始します。
7. 超解像画像取得
- Airyscanと互換性のある目標を選択します。BMタンパク質の細胞内局在を可視化するには、63倍のオイルパージェクティブを使用することが最適です(図3)。対物レンズを63倍に設定し、レンズに液浸オイルをそっと置きます。カバースリップを対物レンズに向けてスライドを対物レンズの上に置き、試料の位置を確認します。
- 以下で説明するように、蛍光色素分子をイメージするための適切な設定を含む構成を選択します。
- [取得]タブの[スマート設定]ボタンをクリックして、新しい実験を設定します。エアリースキャン(超解像)を選択します。これを選択すると、解像度(エアリスキャンSR)、SNR/感度(エアリスキャン焦点)、および速度(マルチプレックスSR-2Y)の間でさらに選択する必要があります。固定組織の場合は、最適な集録が得られるため、[解像度]を選択します。
- [テストの構成] ボックスの [+] をクリックして、トラック/チャンネルを追加します。染料データベースから特定の染料のトラックを選択します。マルチチャンネル実験の場合は、必要に応じて適切な染料を選択して各トラックを追加します。
- すべてのトラックを追加したら、ソフトウェアが提供する実験提案の 1 つを選択します。この実験では、 速度はSmartest(ライン)提案と比較して少し遅くなりますが、各色素に最適なハードウェア設定を作成し、最大の信号ゲインと最小の発光クロストークをもたらすため、Best Signalを使用します。実験が設定されて読み込まれると、[取得] タブの [イメージング設定] ウィンドウに表示されます。
- スマートセットアップが選択されると、検出器GaAsP-PMTの波長範囲が自動的に選択されます。必要に応じて、下部のスクロールバーを移動して範囲を増減するか、範囲を別の領域に完全に移動して範囲を調整します。これを使用して、クロストークを避けるために、2 つの異なるチャネルの範囲が重ならないようにします。後で再利用するために構成を保存します。
- 設定が完了したら、ステップ6.2.8のようにズームとスキャン領域の調整に進みます。スキャン領域を最適化して関心領域に焦点を合わせ、スキャン時間とストレージスペースを削減します。画像の取得に進みます。
- 個々のチャンネルごとに、[チャンネル ]でトラック を選択し、[ ライブ]をクリックします。ステップ6.2.4で説明したように範囲インジケータツールを使用してマスターゲインとレーザー出力を調整し、飽和ピクセルを避けるために説明されているすべてのガイドラインに従います。六角形の検出器ビューが中央に配置され、整列していることを確認するには、[ Airyscan検出器の表示] ボタンをクリックします。ほとんどの場合、六角形の検出器ビューは自動的に中央に配置され、整列されます。追加のチャンネルについても同じ手順を繰り返します。
- [取得モード]トグルウィンドウの [画像サイズ]で、[ SR ](超解像制限ピクセル数)をクリックして、検出器の機能を最大化します。これにより、フレームサイズが自動的に調整されます。
- 通常必要ではないため、平均化を [なし] にしておくと、スキャン時間が短縮されます。場合によっては、平均を 2 倍にすると、信号対雑音比が向上することがあります。
- 8 ビットのデータ深度を持つ生データを収集します。 スナップ をクリックして画像を取得します。Z スタックを取得するには、ステップ 6.3 に従います。
- 以下のように画像処理を行います。これにより、16 ビット イメージが生成されます。
- 画像または z-stack を取得したら、[処理 >方法 ] をクリックし、[ Airyscan処理] を選択します。
- 最初にオートフィルターを実行し、SR値を変更してさらに手動処理を実行して、サンプルの最良の結果を取得します。最適なSR値が決定したら、[ 適用] をクリックして処理された画像を生成します。Zスタック画像の場合は、1つのZスライス(現在の画像[2D])として処理するか、 3D 処理ボックスをクリックしてzスタック全体として処理します。
8. 画像処理とデータ解析(正射影、3D再構成、強度プロファイル)
メモ: この方法では、正射影、3D 再構成、および強度プロファイルの生成に使用される手順が Zen ソフトウェアで説明されています( 材料表を参照)。同様のデータ分析も、ImageJソフトウェア56を用いて実行され得る。
- 下記のように正射影を実行します(図4)。
- 共焦点顕微鏡または超解像顕微鏡を使用して Z スタックを取得したら、正射影を生成して、セルの z 軸の小胞を 2D ビューで表示します (3D 再構成と比較して)。これを行うには、 処理>方法 をクリックし、 正射影を選択します。
- [パラメータ] で、必要な投影平面を選択します。Z 軸(Z スタック)の投影法の場合は、 正面(XY) 平面を選択します。[ 方法]で、[ 最大] を選択して、最高品質の投影結果を生成します。
- 次に、開始位置(開始 Z スライス)を選択して投影の厚さを求め、投影の厚さ (Z スライスの総数) を決定します。Z 軸の 1 つのセルの厚さに等しい厚さを選択するのが理想的です。
- パラメータを設定したら、[ 適用 ]をクリックして、XY平面方式でzスタックの投影を作成します。
メモ: 複数の Z スタックの正射影を作成して、対象の特定のオブジェクトの量を比較する場合、データの精度のために投影の厚さを同じ (またはできるだけ近い) に保つことが不可欠です。
- 以下に説明するように3D再構成を実行します(図5)。
- Z スタックの 3D 再構成を作成して、構造物の局在化と形状を観察します。これは、共焦点および超解像アプローチを使用して取得した z スタックに対して行います。3D 再構成のステップ 7.8 のように、まず 3D 処理を使用して超解像 Z スタックを処理します。
- 3D画像を生成するには、プレビューウィンドウの 3D アイコンをクリックします。クリックすると、画面の下半分の表示コントロールセクションに3Dタブが表示されます。透明度、ボリューム、最大、サーフェス、混合などの 3D ビューが表示されます。小胞の構造を見るときは、サーフェスビューまたは混合ビューを使用します(望ましい)。
- 最高品質の画像の場合は、[ 精度] 設定を選択します。これは、最速の設定では精度が低下し、3D レンダリングが不十分になるためです。
- 画像が生成されたら、回転およびズームして操作し、目的のオブジェクトを表示するための優先位置に焦点を合わせます。「 外観」 タブで 3D イメージを操作します。
- 満足のいくビューが得られたら、[3D]タブで [表示解像度]を選択し、[ イメージの作成]をクリックします。これにより、表示されたのと同じ向きの画像のスナップショットが作成され、さまざまなファイル形式で保存およびエクスポートできます。
- 以下のように強度プロファイルを生成します(図7)。
注:異なる蛍光シグナルに関連するピクセルの分布および強度プロファイルは、それらの共局在を決定するためにオーバーレイ画像として表示することができる。- 共焦点または超解像イメージングによって最適な画像を取得したら、プレビューウィンドウのビューパネルで、[プロファイル]をクリックします。プレビューウィンドウには、距離の関数として強度プロファイルを表示するヒストグラムと、距離と強度の値を示すテーブルが表示されます。
- 画面下部の表示コントロール領域で、[プロファイル定義]タブの矢印ツールをクリックします。さまざまなピクセルの強度プロファイルを評価する必要があるオブジェクトの長さに沿って矢印を描画します。矢印を描画するには、画像を拡大します。
- 強度プロファイルが画像プレビューの左側に表示され、矢印のパスに沿った距離と対応するピークが表示されます。画像自体に表示されているヒストグラムを削除するには、「 グラフィックにプロファイルを表示」 ボックスのチェックを外します。
- 表示コントロール領域の 「寸法」 タブで、強度プロファイルに含めないチャンネルの選択を解除します。
- 「グラフィックス」タブで、「アノテーション/測定」ボックスの下に表示される「プロファイル」をダブルクリックして、「グラフィック要素のフォーマット」ポップアップ・ボックスを開きます。これを使用して、矢印の色、スタイル、線の太さを変更します。必要な設定を選択した後、ボックスを閉じます。
- 「 プロファイル・ビュー」 タブをクリックします。新しい画像セクションで、[ 現在のビュー ] をクリックし、[ 名前を付けて保存] をクリックしてファイルを保存します。データの圧縮と損失を避けるために、ファイルを.tifファイルとして保存することをお勧めします。
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Representative Results
本明細書に記載の方法は、 ショウジョウバエ 卵巣のFEなどの分極上皮細胞におけるBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を効率的かつ正確に画像化し、特徴付けるために使用することができる。次に、上記の方法を使用して得られた予想される結果と、有用なアドバイスと潜在的な落とし穴を提供します。そうするために、内因的にタグ付けされたVkg(ショウジョウバエ ・コルIV)であるVkg−GFPが使用される。しかしながら、Pcan−GFPのような他の内因的にタグ付けされたBMタンパク質でも同じ結果を達成することができる。
最適な集録パラメータの設定(図2)
上皮細胞におけるVkgおよびPcanなどのBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を正確に特徴付けるためには、提供された方法に記載されているように共焦点顕微鏡の取得パラメータを適切に設定することが極めて重要である。
共焦点顕微鏡法を用いて、Vkg-GFPの細胞内局在は、FEに蓄積されて基底的に分泌される前に検出することができる(図2A)。ERでの翻訳後、コルIVは細胞内外球小胞にパッケージ化される前にゴルジ体に輸送されることが示されている。このイメージングアプローチを用いて、我々は、Vkg-GFPが異なる形状の細胞内区画に蓄積し、異なる細胞小器官、エンドソーム区画、および小胞タイプを表す可能性があることを観察した(図2A、矢印)。外cytic vesiclesでは、Coll IVはすでに3つのポリペプチド(2つのα1鎖と1つのα2鎖( ショウジョウバエではVkg)からなる線維に組み立てられており、共焦点イメージングを使用して視覚化することもできる引き伸ばされた小胞の形成につながる(図2A、矢印)。次いで、コルIVは、BMに沈着する上皮細胞から基底的に特異的に分泌される(図 2、矢印)。
取得パラメータが正しく設定されていない場合、BMタンパク質の細胞内輸送中の異なる形態および位置を正確に観察することができない(図2B、C)。例えば、獲得パラメータが細胞内構造ではなく細胞外BMを視覚化するように最適化されている場合、BMタンパク質含有エンドソーム区画および小胞(ここではVkg−GFPでマーク)は薄暗く見えるか、または見えない(図2B)。逆に、検出器が過度に飽和している場合、Vkg-GFPの細胞内局在を最適な状態(図2Aと図2Cを比較)で検出することができるが、バックグラウンド蛍光ノイズの増加により、特に共局在化実験ではBMタンパク質局在の解釈がより困難になる(図7参照)。).全体として、これらのデータは、上皮におけるBMタンパク質の正確な局在化を達成するために適切な獲得パラメータの重要性を示しています。
最適な超解像パラメータとデコンボリューションパラメータの設定(図3)
共焦点画像集録の場合に示されているように、過解像度顕微鏡を使用する場合は、彩度の低下や過飽和を避けるために、集録パラメータを適切に設定することも重要です。この超解像イメージングアプローチには、超解像イメージングを実現するためのデコンボリューションパラメータの慎重な設定も含まれます(図3)。デコンボリューション処理が最適に構成されると、超解像イメージングは、小胞またはゴルジ構造などのBMタンパク質を含む細胞内構造(図3A、矢印)の分解能を有意に増加させ(図3Aおよび図7C)、BM自体(図3A、矢印)、および信号対雑音比を高める45.超解像顕微鏡は、共焦点顕微鏡と比較して、3つの空間次元すべてにおいて分解能が〜2倍向上する。この分解能の増加は、標準的なCSLMで撮影したものと比較して、BMタンパク質および超解像イメージングを使用して撮影されたBMの細胞内トラフィッキングのより明確に定義された画像によって明確に示されている(図2Aおよび図3Aを比較する)。
デコンボリューションパラメータが正しく設定されていない場合、超解像は最適に達成されず、分解能の増加は失われます。超解像画像の過小処理は画像のぼやけにつながり、その結果、BMタンパク質の細胞内局在は薄暗く見え、最適条件下ほど明確に定義されていません(図3Bと図3Aを比較してください)。逆に、画像の過剰処理は、BMタンパク質の細胞内局在がピクセル化して現れる粒状の画像をもたらす(図3C)。これらのデータは、BMタンパク質の細胞内分布を反映する有意義で代表的な画像を達成するために、適切なデコンボリューションパラメータを使用することの重要性を強調している。
全体として、これらのデータは、共焦点顕微鏡と比較して超解像画像処理を使用してBMタンパク質の細胞内輸送の分解能が向上したことを明確に示し、強調している。具体的には、このアプローチは、関与する細胞内構造の分解能を高めることによって、BMタンパク質の細胞内トラフィッキングのより良い可視化を可能にする。これにより、構造の異なるサイズおよび形状の比較が可能になり、FE中のBMタンパク質の偏光沈着に関与する新しい因子をよりよく同定し、特徴付けることができる。
BMタンパク質の細胞内分布の可視化を強化するためのFEを介した光学的z切片(zスタック)の正射影および3D再構成(図4および図5)
BMタンパク質の細胞内分布はFE全体に3D(x軸、y軸、z軸)で存在するため、超解像顕微鏡または共焦点顕微鏡のいずれかを使用して、FEを通る光学z切片の正射影および/または3D再構成を使用して、野生型または変異細胞内のBMタンパク質の局在および分布を評価することができる(例えば、 図4 および 図5)。
正射影を使用すると、取得したすべての Z 断面を 1 つの平面に投影できます。この方法は、共焦点(図4A)または超解像(図4B)画像化を用いて、BMタンパク質を含む小胞および区画の全体的な分布を単一画像で示すのに特に有用である。しかし、共焦点顕微鏡よりも超解像顕微鏡を使用した場合、有意に優れた分解能と少ないバックグラウンドノイズの結果が得られます(図4Bと図4Aを比較してください)。
BM含有コンパートメントおよび小胞の全体的な分布を視覚化する別のアプローチは、共焦点(図5A)または超解像(図5B)イメージングによって撮影された光学zセクションのスタックを組み立てることによって3D再構成を生成することである。このアプローチは、特に超解像顕微鏡を使用する場合、細胞内BMタンパク質の局在化および分布、ならびにVkg-GFPを含む区画および小胞の形状を評価するためにも非常に効率的であり得る(図5)。従来の共焦点顕微鏡(図5A)は、超解像(図5B)と比較してバックグラウンドノイズが高くなり、3Dレンダリングで考慮するとアーチファクトが発生する可能性があります。さらに、共焦点の解像度が低いと、作成された画像は、超解像によって生成された画像よりも滑らかで定義が劣ります(図 5A と 図5Bを比較してください)。
超解像イメージングを用いたBMタンパク質の分極分泌に関与する成分の喪失に関連する表現型の特性評価(図6)
これまでに示されているように(図2、図 3、図 4、および 図5)、超解像顕微鏡および画像処理を使用して、 ショウジョウバエ 卵巣の野生型FEにおけるBMタンパク質の細胞内局在および分布を評価することができる。さらに、このアプローチは、変異体またはノックダウン条件下におけるBMタンパク質の局在を決定および比較するためにも使用することができる。これにより、これは、BMタンパク質の分極細胞内輸送、分泌、および沈着に特化した新たに同定された成分の役割を特徴付けるための効率的な方法である。
GTPase交換因子(GEF)Cragは、BMタンパク質28の分極沈着に特化した生物学的経路における重要な構成要素であることが示されている。CragノックダウンFCでは、BMタンパク質が頂端と基底の両方に蓄積し、 Crag がVkg-GFPなどのBMタンパク質の分極分泌を制御していることを示しています(図6)。超解像顕微鏡の使用は、Cragの喪失から生じる表現型のより良い特性評価を可能にする。例えば、BMタンパク質の強力な頂端蓄積、ならびに異所性頂端BMの組織化が、 クラッグノックダウンFCにおいて観察される(図6B、矢じり)。また、表現型が異常度が低い場合には、FCs中の小さなパッチに頂端的に蓄積するBM膜が検出される(図6B、矢印)。全体として、これらのデータは、BMの偏光沈着に関与する成分の役割をよりよく理解するために、突然変異表現型を特徴付けるために超解像顕微鏡法を使用できることを示している。
共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡を用いて画像化した抗体および内因的にタグ付けされたBMタンパク質を用いた共局在化実験(図7)
最後に、特定の細胞内マーカーまたは新たに同定された成分に対する抗体を内因的にタグ付けされたBMタンパク質と組み合わせた使用は、分極上皮におけるBMタンパク質の細胞内輸送および分泌をより良好に特徴付けるために使用することができる。シスゴルジマーカーであるGM-130は、この点を説明するために使用されます。分泌小胞に包装される前に、コルIVはゴルジ体に輸送される。共焦点(図7A,B)または超解像(図7C,D)イメージングを用いてVkg-GFPの細胞内分布を評価すると、どちらのアプローチもVkg-GFPがGM-130と部分的に共局在することを示し、コルIVが分泌前にゴルジ体に選別されることを確認する。しかし、超解像イメージングを使用すると、Vkg-GFPとGM130の間の共局在の増加と共局位の分解能の向上が観察されます(図7Aと図7Cを比較してください)。
また、共焦点(図7B)および超解像(図7D)顕微鏡で撮影したFCを介した光学断面の蛍光強度を測定することにより、緑(Vkg-GFP)および赤色(GM-130)画素の空間分布およびレベルを定量化すると、Vkg-GFPおよびGM-130の共局在が観察される。Vkg-GFPおよびGM-130ピクセルの分布は、Vkg-GFPおよびGM-130ピークの重なりがそれらの共局在を示すヒストグラムにプロットされる(図7B',D')。したがって、この画像解析ツールを用いて、特定の細胞内区画におけるVkg-GFPの位置を正確に決定することができる。しかし、共焦点画像(図7B')から生成されたヒストグラムと超解像(図7D')画像を比較すると、ピークの強度が高く、より小さなピークの欠如によって表されるバックグラウンドノイズが低減されたことからわかるように、超解像顕微鏡がより良い結果をもたらすことが確認されています(図7B'と図7D'を比較してください)。) は、超解像で生成されたヒストグラムに関連付けられています。全体として、これらのデータは、共焦点顕微鏡法を使用して共局在化を定量化することができるが、超解像はより強力なアプローチであり、局在化のより効率的かつ正確な定量化につながることを強調している。
図1: ショウジョウバエ 卵巣の濾胞上皮(FE):基底膜(BM)タンパク質の分極沈着を研究するためのモデル系。 (a)解剖・切除後の無傷の卵巣を蛍光実体顕微鏡で撮影した画像。卵巣は内因性GFPタグ付きBMタンパク質(Vkg−GFP)を発現している。スケールバー= 1mm(A')雌のハエの2つの卵巣が卵管に取り付けられています。各卵巣には16〜20個の卵巣が含まれています。単一の卵巣が輪郭を描かれている(長方形)。スケールバー= 1mm. (B)縦断面を共焦点顕微鏡で撮影し、Vkg-GFPを発現する卵巣を通して、DNA(青)およびF-アクチン(赤)について染色した。卵巣は、異なる段階で卵室で構成されています。卵室は、生殖細胞系細胞(GC)を囲む単層濾胞上皮(FE)で構成されています。FEはBMタンパク質(例えば、PcanおよびVkg)を合成し、基底的に分泌する。スケールバー = 100 μm. (C) FEの回路図。FEは、頂端ドメインが生殖細胞系列細胞に面し、基底ドメインがBM(緑色)に面する明確な頂端 - 基底極性を有する古典的な上皮である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共焦点イメージングを用いてBMタンパク質の細胞内輸送をイメージングする(A-C)Vkg-GFPを発現する卵室を通る縦断面(緑)およびDNA染色(青)およびF-アクチン(赤)。(A'-C')Vkg−GFPを含む細胞内区画および小胞(矢印)、ならびに基底および細胞外に沈着したBM(矢じり)を、共焦点顕微鏡を用いて示す。(A)Vkg-GFPの細胞内トラフィッキングが見える最適に取得された画像。(A')Vkg−GFPは、異なる細胞区画(例えば、ゴルジ体)および小胞内のFCの細胞質全体に局在する。IV型コラーゲンの線維組織のために、Vkg-GFP含有小胞は細長く見える(矢印)。(B)取得パラメータが、BMタンパク質の細胞内分布ではなく、細胞外BMを視覚化するように最適化されている露出不足の画像。Vkg-GFP(緑色)は細胞質(B ́)全体にわたって薄暗く見え、その結果、(A)と比較して検出不能なVkg-GFP含有小胞が生じる。(c)GFP検出器が飽和し、背景蛍光の増加をもたらす過露光画像。Vkg-GFP(緑色)の細胞内分布はFCの細胞質全体に局在しているのが見られるが(矢印)、過剰ばく露は(A-A')のように細胞内構造がそれらよりも大きく見えるイメージングアーチファクトをもたらす。スケール バー = 5 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:超解像イメージングとプロセシングを用いたBMタンパク質の細胞内トラフィッキングのイメージング。 (A-C)縦断面はVkg−GFPを発現する卵室(緑色)を通り、DNA(青色)およびF−アクチン(赤色)について染色した。(a)最適に処理された超解像画像で、Vkg-GFPの細胞内トラフィッキングが明瞭に観察されるものである。(A')Vkg−GFPは、異なる細胞区画(例えば、ゴルジ)および小胞(矢印)およびBM(矢じり)においてFCの細胞質全体に局在する。(B)(A)よりも高いバックグラウンド蛍光を生じる過小処理画像。Vkg-GFP(緑色)の細胞内局在は薄暗く、あまり定義されていないように見える(BとAを比較する)。(c)Vkg-GFPの細胞内局在が画素化してざらつきのある画像となる過大処理画像。スケール バー = 5 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡アプローチを用いて取得および処理されたzスタックの正射影。 (A-B) Vkg-GFP(緑)を発現し、共焦点(A)または超解像(B)顕微鏡を用いてDNA(青)およびF-アクチン(赤)を染色した卵室を通る光学的z切片の正射影。(A)最適な共焦点パラメータを使用して取得したzスタックの投影。Vkg-GFPの細胞内局在は、FCのz軸全体にわたって観察することができる(A'、矢印)。BMも見え、非常に明るく見えます(A'、矢印)。(B)最適な超解像処理を用いて取得したzスタックの投影。Vkg-GFPを含む明確に定義された細胞内区画および小胞は、FCのz軸全体にわたって観察することができる(B ́、矢印)。BMも非常に明確に定義されています(B ́、矢印)。標準共焦点イメージングと超解像イメージングの違いは明らかであり、Vkg-GFPおよびBMの細胞内局在は、標準共焦点顕微鏡法よりも超解像法を使用する場合に有意に多く定義される。また、共焦点顕微鏡で撮影した画像は、背景蛍光が高い。スケール バー = 5 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡アプローチを用いて取得および処理されたzスタックの3D再構成(A-B)Vkg-GFPを発現し、DNA(青)およびF-アクチン(赤)を染色した卵室のzスタックの3Dレンダリング(混合図)。(A)共焦点顕微鏡で取得したzスタックの3Dレンダリング。Vkg-GFPを含む区画および小胞の位置および形状は、細胞(A ́)全体にわたって見ることができる。(B)最適な超解像処理により取得したzスタックの3Dレンダリング。Vkg-GFPを含む区画および小胞の位置および形状を見ることができる(B ́)。小胞の形状、ならびにBMおよび核は滑らかに定義されており、共焦点顕微鏡のそれと比較して分解能が高い(B'およびA ́と比較して)。Vkg-GFPを含む区画および小胞の形状およびサイズは、超解像顕微鏡(B'およびA ́と比較して)を用いてよりよく決定することもできる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:CragにおけるVkg-GFPローカリゼーションの特性評価は、FCをノックダウンさせた。 (A-B)縦断面は、Vkg-GFP(緑)を発現する卵室を通り、DNA(青)およびF-アクチン(赤)について染色し、最適な超解像処理を介して取得した。(a)適切なBM沈着に重要なタンパク質である野生型Cragを発現する対照株。FEは典型的なBMタンパク質局在を示し、ここでVkg−GFPは細胞内に分布し、FE(A ́)中に基底的に沈着する。(b)トランスジェニックショウジョウバエ株は、FEにおいてCragに対するRNAiを発現し、Cragノックダウンをもたらす。Cragの喪失は、FE(B ́、矢印および矢じり)における頂端のBMタンパク質(例えば、Vkg−GFP)の誤局在化をもたらす。超解像画像は、Cragの喪失に関連するBMミスローカリゼーション表現型を特徴付けるために使用される。具体的には、いくつかのCrag RNAi FCは、BMタンパク質の強い頂端的ミス局在(B ́、矢じり)を示し、他のCrag RNAi FCはより弱い頂端ミスローカリゼーション(B ́、矢印)を示す。超解像イメージングは、Cragの喪失に関連する表現型を明確に明らかにする(B'、矢じり対矢印)。スケール バー = 5 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡アプローチを用いたVkg-GFPおよびGM-130(ゴルジマーカー)の共局在。 (A-D)Vkg-GFPを発現し、シス-ゴルジマーカー(GM-130、赤)について免疫染色した卵室を通る縦方向切片、共焦点(A、B)または超解像(C,D)顕微鏡を用いて画像化。(A,B)共焦点イメージングは、細胞内Vkg-GFPがシス-ゴルジマーカー(A、矢印)と部分的に共局在することを示している。(B)(A)のズームイン領域。白矢印に沿った緑(Vkg-GFP)と赤(GM-130)ピクセルの分布は、ヒストグラム(B')にプロットされます。ヒストグラムの x 軸は矢印に沿った距離 (μm) を表し、Y 軸はピクセル強度を表します。重なり合う緑と赤のピーク(*)は、Vkg-GFPとGM-130が共局在する場所を示しています。(C,D)超解像イメージングはまた、細胞内Vkg-GFPがシス-ゴルジマーカー(C、矢じり)と部分的に共局在することを示している。(D)(C)のズームイン領域。白矢印に沿った緑 (Vkg-GFP) と赤 (GM-130) ピクセルの分布は、ヒストグラム (D') にプロットされます。ヒストグラムの x 軸は矢印に沿った距離 (μm) を表し、Y 軸はピクセル強度を表します。重なり合う緑と赤のピーク(*)は、Vkg-GFPとGM-130が共局在する場所を示しています。これらのデータは、超解像イメージングが共局在化を特徴付けおよび定量化するための共焦点イメージングよりも効率的で正確なアプローチであることを示しています。スケール バー = 5 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:代表的な画像の共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡の取得および処理パラメータ。 すべての主要なイメージングパラメータは、提供された代表的な画像用にコンパイルされます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
BMは、胚および器官の形態形成、ならびに成人の生理学的機能にとって重要である。さらに、BMは、上皮極性の確立および維持のためのシグナル伝達プラットフォームとして機能し、組織に支持体2を提供する。しかし、BMタンパク質の適切な配置を調節するメカニズムはほとんど理解されていない。BMタンパク質の細胞内輸送および分極分泌に特化した生物学的経路をよりよく理解するには、これらの経路の構成要素およびBMプロセシングにおけるそれらの役割の慎重な分析が必要である。これを実現する1つの方法は、共焦点イメージングと超解像イメージングを使用することです。ここでは、共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡を用いてFE中のBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を効率的に画像化するための ショウジョウバエ 卵巣の調製および染色または免疫染色の方法について説明した。
野生型および変異型条件下でのBMタンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化するためのタンパク質トラップおよび内因性タグ付きタンパク質の利点
提供されたプロトコルは、タンパク質トラップおよび内因的にタグ付けされたBMタンパク質(例えば、Vkg−GFPおよびPcan−GFP)を最大限に活用して、野生型(対照)および変異状態におけるFE中のBMタンパク質の局在および分布を画像化および評価する。これらの系統は、BMタンパク質に対する抗体の使用よりも重要な利点を有する。第一に、目的の特定のタンパク質に対する抗体は、しばしばまれであり、存在量が少ない。さらに、抗体に関連する組織浸透度にはしばしば問題があり、目的のタンパク質の正確な観察および評価につながる可能性があります。さらに、タンパク質トラップラインは、(i)遺伝子発現を操作する方法(例えば、UAS/Gal4)、(ii)変異体、および(iii)RNA干渉(RNAi)ラインなど、BMの適切な沈着に必要な因子の機能を決定するために使用される異なる遺伝学背景に挿入することができる。最後に、これらのタンパク質トラップは、ライブイメージング57を用いてBMの局在化および機能を視覚化するために使用することができる。
しかしながら、目的のタンパク質への蛍光タグの融合は、その局在および機能を妨げる可能性がある。したがって、タンパク質に対するタグの異常な影響を評価することが重要です。蛍光タグの付加がBMタンパク質の機能および局在化を妨げないことを確実にする1つの方法は、トランスジェニックショウジョウバエ系統がホモ接合性生存可能かどうかを判断することである。ここおよび以前に記載された異なる実験で使用されたVkg−GFPおよびPcan−GFP株の両方がホモ接合性生存可能であり、GFPタグの付加がこれらの必須タンパク質の機能を妨げないことを示している29,30。
イメージングのための組織調製、固定、染色の重要性
FEを効率的かつ正確に画像化するためには、この方法の指示どおりに卵巣組織を適切に調製、固定、染色することが重要です。まず、解剖後、他のすべての臓器を慎重に取り除き、固定前に破片を飛ばします。パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して組織を固定することは、明るいGFP蛍光をもたらし、ほとんどの抗体と適合性があるため、推奨される。しかしながら、PFAはすべての抗体と適合性があるわけではない。いくつかはグルタルアルデヒドまたはメタノール固定を必要とするかもしれません。さらに、一次抗体の非特異的結合によるバックグラウンド蛍光を避けるために、卵巣組織を、ブロッキング溶液中で少なくとも1時間、ナットリングプラットフォームロッカー上でインキュベートし、プロトコールに記載されているように一次抗体および二次抗体インキュベーション後に数回広範囲に洗浄すべきである。最後に、卵巣組織の適切な取り付けは、最適なイメージングを達成するために不可欠です。これには、個々の卵室を慎重に分離して、それらが互いに積み重なることを避ける必要があります。また、カバースリップの下の組織の浮遊を避けるために、イメージング前に取り付け媒体を完全に重合させることも重要です。これにより、マウントメディアは最適な反射率に達することができ、これは超解像イメージングにとって非常に重要です。そうしないと、画質に影響します。さらに、調製したスライドは、蛍光が消光される前に、4°Cで最大1ヶ月間保存することができる。提供されたプロトコールに加えて、いくつかの他のプロトコールが卵巣解剖および染色のために利用可能である53、54、55。
適切な取得およびプロセシングパラメータの使用は、最適なイメージングのために、また共焦点および超解像イメージングを使用してBMタンパク質の局在を評価するために重要です。
前述のように、検体の最適な画像を得るためには、共焦点および超解像イメージングの取得パラメータを適切に設定することが重要です。画像集録の場合、ズーム機能を使用してROIを慎重に選択し、フレームサイズと集録速度を最適に設定する必要があります。さらに、 図2に示すように、レーザー出力と検出器ゲインを適切に調整して、検出器を飽和させることなく細胞内輸送を視覚化することが重要です。これらのパラメータは、露出不足または露出過多の画像を避けるために、非常に慎重に設定する必要があります(図2)。露出不足の画像は低解像度の画像になり、細胞内構造の視覚化と特性評価が困難になります(図2B)。検出器の飽和による露出過多の画像は、データの誤った解釈と共局在化アーチファクトにつながります(図2C)。目的が内因的にタグ付けされたBMタンパク質の小胞局在を決定することである場合、基礎BMにおけるGFPタグ付きタンパク質(例えば、Vkg−GFPおよびPcan−GFP)からの蛍光は、検出器を迅速に飽和させる。しかしながら、GFPタグ付きBMタンパク質をあまり含まない小胞は、薄暗く見えるであろう。したがって、BM上ではなく、BM含有細胞内構造(例えば、小胞)を用いて画像感度を設定することが重要です(図2)。ピンホールサイズを選択することも非常に重要です。理想的には、特に z 軸の解像度が重要な場合は、最高品質の画像を得るために、チャンネルごとに 1 AU のピンホールサイズを選択する必要があります。ピンホールサイズが小さいほど、光学セクションの薄型化に最適です。ただし、最適な Z 軸分解能が必要ない場合、または Z スタックがキャプチャされていない場合は、ピンホールのサイズを大きくしてフォトブリーチングを回避できます。さらに、非常に暗い信号の場合、ピンホールサイズを大きくすると、信号対雑音比が高くなり、より多くの光子がキャプチャされるため、データの解釈に役立ちます。
超解像イメージングでは、 図 3 に示すように、解像度の低い過小または過大処理の画像が生成されないように、デコンボリューション処理に特に注意する必要があります。最後に、最適な3D再構成を実現するには、ソフトウェアによって決定される最適な間隔を設定することを強くお勧めします。Z セクション間の間隔が大きすぎる (つまり、0.5 μm より大きい) と、3D レンダリングが悪くなり、その後の表現型の解析に影響します。
BM細胞内トラフィッキングをイメージングする際の従来の共焦点顕微鏡に対する超解像の利点
結果セクションに示されているように、BMタンパク質の局在化および分布は共焦点イメージングを用いて正確に評価することができるが、記載された超解像アプローチは、BMタンパク質を含む細胞内構造の分解能の大幅な増加および強化されたシグナル対ノイズ比を伴う、より正確なイメージングデータを生成する。さらに、この超解像顕微鏡技術は比較的使いやすい。超解像イメージングは、共焦点顕微鏡と比較して、x軸およびy軸で最大120nm、z軸で350nmまで、分解能を大幅に向上させるため、このアプローチは、FCなどの上皮細胞におけるBMタンパク質の細胞内輸送および分泌をより正確に特徴付けることによって、BMの偏光沈着の理解に大きな影響を与える。
さらに、別の超解像イメージングアプローチ(構造化照明顕微鏡、SIM)および点走査共焦点顕微鏡用に設計されたデコンボリューションアルゴリズムの使用(すなわち、ニコンの高分解能ソフトウェアモジュール)は、BM沈着に関与する因子の役割を特徴付けるために以前に使用されてきた29。これらの技術に関連する分解能の向上は、BMタンパク質の細胞内輸送およびBMの組織化に関する我々の理解に重要な洞察を提供してきた。しかしながら、これらのアプローチは、Airyscan顕微鏡と比較していくつかの制限を提示する。例えば、SIMは、組織の奥深くにある光学的z切片を取得する際に最適な画像を取得するのにあまり効率的ではない。これにより、BM沈着に関与する新しい成分をスクリーニングする際にSIMを使用することが困難になります。さらに、共焦点画像に適用されるデコンボリューションアルゴリズムの使用は、同じレベルの超解像を達成しない。全体として、固定組織上のAiryscan超解像イメージングは、BM細胞内輸送および沈着を研究するための強力で優れたアプローチです。
しかし、他の超解像顕微鏡と同様に、このアプローチにはいくつかの不便さも関連しており、イメージング中に考慮する必要があります。第1に、超解像モードは、通常、共焦点モードよりも長いサンプルの取得時間を必要とする。したがって、取得パラメータおよび関心領域は、サンプルのフォトブリーチングを最小限に抑えるために慎重に設定する必要があります。さらに、超解像顕微鏡で生成された画像ファイルは、共焦点顕微鏡で生成されたファイルよりもはるかに大きく、画像処理や保存のために特殊なコンピュータやサーバーが必要になる場合があります。
最後に、 ショウジョウバエ の卵子形成中のBMタンパク質のライブイメージングが、BM極性に関与する新しい因子を特徴付けるために使用されている57。しかしながら、このアプローチには限界があり、特にBMタンパク質トラフィッキング中の細胞内構造の分解能には限界がある。超解像顕微鏡は、BMタンパク質の偏光沈着における同定された因子の役割を正確に決定するために、ライブイメージングと組み合わせて使用する強力なアプローチです。
内因性にタグ付けされたタンパク質および超解像イメージングを使用して、小胞輸送に特化した細胞内成分の局在を研究するためのこの方法の他の用途
発生中および成体生物における組織および器官の確立および維持は、細胞間シグナル伝達および細胞の緊張および接着に部分的に依存する。これらのプロセスは、細胞内輸送、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、および特定のタンパク質の分泌に依存する。したがって、内因的にタグ付けされたタンパク質および共焦点および超解像顕微鏡法を用いてBMの細胞内輸送を解読するための本明細書に記載の方法は、各プロセスを研究するために容易に適合することができた。さらに、内因性にタグ付けされたタンパク質を生成するためのCRISPR/Cas9媒介遺伝子編集の使いやすさは、このアプローチをさらに汎用性と強力にしています58。
結論として、我々は、共焦点および超解像顕微鏡を用いて ショウジョウバエ 卵巣のFEにおけるBMタンパク質の調製およびイメージングのための方法を説明した。これらのプロトコルは、BMタンパク質の適切な配置に特化した新しい成分を同定するためのハイスループットスクリーニングに適用することができます。最後に、この方法論の採用は、上皮細胞が上皮構造の確立と維持における重要なプロセスであるBMタンパク質の分極分泌をどのように制御するかについての我々の理解に大きく貢献する可能性がある。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者は、原稿に関する彼女の有益なコメントのためにジュリー・マークルに感謝しています。この研究は、NIHの助成金R15GM137236からO.D.への支援を受けた。共焦点および超解像画像は、NSF MRIグラント2018748で購入したAiryscan 2を搭載したツァイスLSM 900を使用して取得されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
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