Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Summary

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Abstract

La membrana basale (BM) - un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali - è fondamentale per l'istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L'imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l'elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l'identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l'imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l'identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.

Introduction

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi¹. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti ^1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cui la separazione e la barriera dei tessuti, la crescita e il supporto e la polarizzazione cellulare ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Il suo ruolo di piattaforma di segnalazione regola la morfologia e la differenziazione delle cellule epiteliali e dei tessuti durante lo sviluppo ^3,13,14. Inoltre, l'errata regolazione del BM e/o una violazione della sua integrità sono le cause primarie di molte condizioni patologiche, tra cui le metastasi tumorali ^2,15,16. Nonostante le funzioni essenziali svolte dal BM durante la morfogenesi tissutale e d'organo, i componenti delle vie biologiche dedicate al traffico intracellulare polarizzato e alla secrezione di proteine BM sono vagamente note.

Per studiare il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e la secrezione di proteine BM da parte delle cellule epiteliali, l'epitelio follicolare (FE) dell'ovaio Drosophila è un potente sistema modello (Figura 1). Un'ovaia di Drosophila comprende 16-20 strutture lunghe simili a tubi, chiamate ovarioli (Figura 1A,B)17,18,19. Ogni ovariole può essere pensato come una catena di montaggio dell'uovo, con la progressione dell'età delle camere dell'uovo (che danno origine a ciascuna un uovo) che inizia all'estremità anteriore e si muove posteriormente, fino a quando l'uovo maturo esce attraverso l'ovidotto. Ogni camera uovo è incapsulata dal FE, un monostrato di cellule follicolari somatiche (FC), che circonda le cellule germinali centrali (GC). Il FE è altamente polarizzato con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso la linea germinale e le proteine BM sono secrete basalmente^18,19. I FC secernono attivamente tutti i principali componenti del BM, tra cui Collagen IV, Perlecan e Laminins ^20,21. Nelle cellule epiteliali come le FC, i componenti BM sono prodotti e richiedono una via di secrezione polarizzata specializzata per la loro deposizione extracellulare. Ad esempio, nel caso del componente più abbondante del BM, collagene IV (Coll IV), i dettagli che circondano il suo traffico intracellulare polarizzato e la secrezione sono vaghi nonostante la sua produzione e deposizione siano al centro di molti studi. Coll IV è tradotto nel reticolo endoplasmatico (ER), che è anche dove ogni fibrilla - composta da tre polipeptidi (due catene α1 e una catena α2) - è assemblata in una tripla elica²². Il corretto ripiegamento e funzione di Coll IV richiedono chaperoni ed enzimi ER, tra cui lisil e prolil-idrossilasi come Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Questi enzimi post-traduzionali regolano lo smistamento ER di Coll IV, poiché la perdita di ciascuno fa sì che Coll IV sia intrappolato nell'ER basale 20,23,24,25,26. Quindi, il Coll IV appena sintetizzato esce dal pronto soccorso per il Golgi in vescicole rivestite copiose. Il recettore di carico Tango1 aiuta a confezionare i collageni in vescicole legate al Golgi di grandi dimensioni che possono ospitare grandi proteine multimeriche^20,27. Una volta che Coll IV è confezionato in vescicole esocitiche intracellulari, viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali. Per dirigere la deposizione di BM sul lato basale, le cellule epiteliali richiedono un altro insieme di fattori specificamente dedicati alla secrezione di BM polarizzata. Utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila, sono stati caratterizzati alcuni componenti di questo nuovo processo cellulare, tra cui i fattori di scambio nucleotidico (GEF) Crag e Stratum, le GTPasi Rab8 e Rab10, nonché i livelli del fosfoinositide PI(4,5)P2 e le proteine motorie Kinesin 1 e 3 20,28,29,30,31 . Questi componenti sono fondamentali per garantire la distribuzione polarizzata delle proteine BM.

Per monitorare la localizzazione intracellulare delle proteine BM nella FE, possono essere utilizzate proteine di membrana basale endogenamente marcate (trappole proteiche), come Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. Queste linee di trappola proteica hanno dimostrato di riflettere accuratamente la distribuzione endogena delle proteine BM e consentono un rilevamento più sensibile del traffico vescicolare^28,30. I componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM nel FE sono stati inizialmente caratterizzati utilizzando linee di trappola proteica per Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Le trappole proteiche possono essere utilizzate in diversi background genetici, compresi i mutanti e le linee Gal4 ³⁴. Inoltre, le trappole proteiche possono essere utilizzate in combinazione con coloranti fluorescenti e/o immunocolorazione a fluorescenza, consentendo una caratterizzazione precisa della localizzazione delle proteine BM quando si confrontano le condizioni wild-type e mutanti³⁵.

Per valutare in modo accurato ed efficiente la distribuzione e la localizzazione delle vescicole contenenti proteine BM, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e le tecniche di imaging a super-risoluzione presentano un vantaggio significativo rispetto ad altri approcci di imaging. Questi approcci accoppiano l'imaging ad alta risoluzione con una relativa facilità d'uso. CLSM è una tecnica di microscopia che consente una migliore risoluzione ottica scansionando il campione con un laser in modo raster utilizzando galvanometri. L'apertura stenopeica è un componente fondamentale di un microscopio confocale. Bloccando i segnali fuori fuoco provenienti da sopra o sotto il piano focale, l'apertura stenopeica si traduce in una risoluzione altamente superiore nell'asse z³⁶. Ciò consente anche di ottenere una serie di immagini nel piano z, chiamato z-stack, corrispondente a una serie di sezioni ottiche. Z-stacks crea successivamente un'immagine 3D del campione, tramite ricostruzione 3D, con l'ausilio di software di imaging. I microscopi a epifluorescenza (widefield) convenzionali, a differenza dei microscopi confocali, consentono alla luce sfocata di contribuire alla qualità dell'immagine, diminuendo la risoluzione dell'immagine e il contrasto^36,37. Ciò rende la microscopia a epifluorescenza un candidato meno attraente quando si studia la localizzazione o la colocalizzazione delle proteine.

Sebbene CLSM sia un approccio adatto per varie applicazioni, tra cui l'imaging e la caratterizzazione del traffico intracellulare di proteine BM, presenta ancora un problema quando si visualizzano campioni al di sotto del limite di diffrazione della luce di Abbe (200-250 nm). Quando si esegue l'imaging di tali campioni, la microscopia confocale, specialmente quando si utilizza un obiettivo ad olio, può portare ad un'alta risoluzione. Tuttavia, le tecniche di super-risoluzione superano il limite della microscopia confocale. Esistono vari approcci per ottenere la microscopia a super-risoluzione, ognuno con limiti di risoluzione specifici e ciascuno appropriato per analisi diverse. Questi approcci includono microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e microscopia Airyscan (super-risoluzione) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Sebbene Airyscan abbia una risoluzione più grossolana di PALM / STORM, STED e SIM, può comunque raggiungere una risoluzione fino a ~ 120 nm (circa il doppio della risoluzione di CLSM). Inoltre, questo approccio di microscopia a super-risoluzione ha dimostrato di avere un vantaggio rispetto alla SIM e ad altre tecniche di super-risoluzione quando si visualizzano campioni spessi e campioni con un basso rapporto segnale-rumore^47,48.

Airyscan è una tecnologia di microscopia confocale a super-risoluzione relativamente nuova⁴⁶. A differenza dei CLSM tradizionali, che utilizzano i rilevatori stenopeici e a punto singolo per respingere la luce fuori fuoco, questo approccio a super-risoluzione utilizza un rilevatore di area del tubo fotomoltiplicatore a 32 canali di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) che raccoglie tutta la luce in ogni posizione di scansione⁴⁵. Ciascuno dei 32 rivelatori funziona come un piccolo foro stenopeico, riducendo le dimensioni del foro stenopeico dalla tradizionale 1.0 Airy Unit (A.U.) a una maggiore 0.2 A.U., consentendo una risoluzione e un rapporto segnale-rumore ancora più elevati, pur mantenendo l'efficienza di un diametro 1.25 A.U.⁴⁵. Inoltre, la deconvoluzione lineare utilizzata da Airyscan si traduce in un aumento fino a 2 volte della risoluzione⁴⁵. Tenendo conto di ciò, i CLSM, e in particolare la microscopia a super-risoluzione, sono adatti per studiare le proteine BM e le proteine che regolano la deposizione basale delle proteine BM, in quanto possono produrre immagini ad altissima risoluzione per studi di localizzazione e colocalizzazione, fornendo così nuove intuizioni sugli eventi spaziali, temporali e molecolari che controllano questi processi.

Un approccio alternativo alla microscopia confocale che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di localizzazione è la deconvoluzione delle immagini. Poiché la microscopia a largo campo consente alla luce fuori fuoco di raggiungere i rivelatori, è possibile applicare algoritmi di deconvoluzione matematica e computazionale per rimuovere o riassegnare la luce fuori fuoco dalle immagini ottenute con la microscopia a campo largo, migliorando così la risoluzione e il contrasto dell'immagine⁴⁹. Gli algoritmi di deconvoluzione possono essere applicati anche alle immagini confocali per aumentare ulteriormente la risoluzione e il contrasto, producendo immagini finali quasi paragonabili a quelle della microscopia a super-risoluzione⁵⁰. Airyscan utilizza la deconvoluzione basata sul filtro Weiner insieme alla riassegnazione dei pixel di Sheppard, con conseguente miglioramento della risoluzione spaziale e del rapporto segnale-rumore. Rispetto alla microscopia confocale, si osserva un aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali (120 nm in x e y e 350 nm in z) quando si utilizza questa tecnica di microscopia a super-risoluzione ^45,51.

Questo manoscritto fornisce protocolli dettagliati e ottimizzati per macchiare, acquisire e visualizzare il traffico intracellulare e la deposizione di proteine BM utilizzando il FE dell'ovaio Drosophila come sistema modello accoppiato con microscopia confocale e super-risoluzione. Le linee di Drosophila che esprimono proteine di membrana basale endogenamente etichettate, ad esempio Vkg-GFP e Pcan-GFP, sono strumenti efficienti e accurati per visualizzare il traffico e la secrezione di proteine BM. Inoltre, possono essere facilmente utilizzati in diversi background genetici, tra cui mutanti e Gal4 / UAS linee³⁴. Sebbene si raccomandino proteine di membrana basale marcate endogenamente, l'uso di anticorpi contro specifiche proteine BM è anche compatibile con i protocolli descritti. Questi protocolli sono particolarmente utili per gli scienziati interessati a studiare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel tessuto epiteliale intatto utilizzando l'imaging confocale e super-risoluzione. Inoltre, la capacità di combinare l'analisi del tessuto epiteliale con gli strumenti espansivi della genetica Drosophila rende questo approccio particolarmente potente. Infine, questi protocolli potrebbero essere facilmente adattati per studiare il traffico vescicolare e lo smistamento di altre proteine di interesse.

Protocol

1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche

1. Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L'aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in quanto ciò può influire negativamente sullo sviluppo delle ovaie.
   NOTA: Descrizione di Maschi e femmine di Drosophila e consigli utili e consigli per gli scienziati senza precedente esperienza di Drosophila possono essere trovati negli articoli citati^34,52. L'aggiunta di lievito stimolerà la produzione di uova e genererà ovaie con diversi stadi rappresentati. Inoltre, ingrasserà anche le ovaie e le renderà più facili da asportare. Il lievito umido può anche essere usato al posto del lievito granulato, tuttavia, per le scorte più deboli, le mosche possono rimanere bloccate e morire.

2. Dissezione e fissazione delle ovaie

NOTA: Per ulteriori risorse sulla dissezione e la colorazione delle ovaie, i lettori sono indirizzati ai protocolli^citati 53,54,55.

1. Il giorno della dissezione, preparare una soluzione di fissazione fresca con una concentrazione finale di paraformaldeide al 4% (PFA) diluendo la soluzione madre di PFA in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS).
2. Anestetizzare le mosche usando CO₂ e posizionarle su un fly pad. Tenere le mosche anestetizzate fino alla dissezione. Considera le mosche correttamente anestetizzate una volta che i loro movimenti sono cessati, che di solito richiede 10-20 s.
   NOTA: Sebbene l'uso di CO₂ sia raccomandato come opzione più sicura e veloce, le mosche possono essere anestetizzate usando il ghiaccio.
3. Posizionare un vetrino concavo o un piatto colorante con pozzetti di depressione poco profondi sotto un microscopio di dissezione e riempire i pozzetti con 1x PBS.
4. Afferra una mosca femmina al torace inferiore usando un paio di pinze. Garantire il sesso delle mosche dall'assenza di genitali maschili all'estremità posteriore dell'addome e dall'assenza di pettini sessuali sulle zampe anteriori come caratteristica secondaria⁵². Sezionare le mosche individualmente usando un altro paio di pinze (passo 2.5) mentre le immerge in pozzetti riempiti con 1x PBS sotto il microscopio di dissezione (si raccomanda un ingrandimento 20x).
5. Mentre guardi attraverso il microscopio di dissezione, usa un altro paio di pinze per tirare la parte posteriore dell'addome della mosca, rendendo visibili gli organi interni (ad esempio, ovaie, intestino).
6. Spremere delicatamente la parte anteriore dell'addome della mosca (come con un tubo di dentifricio) per costringere le ovaie a uscire dall'addome. Questo metodo dovrebbe mantenere intatte le ovaie. Staccare e rimuovere con cura altri organi e detriti di mosca.
7. Usando pinze o aghi di dissezione, separare gli ovarioli dell'ovaio mantenendo intatta la struttura ovarica complessiva. Lo scopo di questo passaggio è quello di rompere la guaina muscolare che copre le ovaie e consentire una colorazione più efficiente e omogenea.
8. Trasferire rapidamente le ovaie in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1x PBS e mantenere il tubo sul ghiaccio fino a quando tutte le mosche non vengono sezionate. Non tenere il tubo sul ghiaccio se i microtubuli o i microfilamenti (o le vescicole trafficate da questi componenti citoscheletrici) devono essere visualizzati in quanto ciò può causare depolimerizzazione.
9. Una volta che tutte le ovaie sono state sezionate e trasferite in un tubo microcentrifuga, lasciarle affondare sul fondo del tubo e rimuovere tutti tranne ~ 50 μL del PBS. Aggiungere 1 mL di PFA al 4% e posizionare su un bilanciere a piattaforma nutating per 15 minuti. È importante verificare se le ovaie si muovono avanti e indietro nella soluzione di fissazione per consentire una corretta fissazione poiché la fissazione incompleta potrebbe portare a problemi di colorazione e imaging.
   NOTA: la velocità del nutator non è cruciale. Mentre alcuni nutator hanno un controllo della velocità, altri sono dotati di una velocità preimpostata. La velocità preimpostata è sufficiente e, se regolabile, impostata su 40-50 giri/min.
10. Rimuovere la soluzione di fissazione (come nel passaggio 2.9), quindi eseguire due lavaggi rapidi con 1 mL di 1x PBS contenente lo 0,1% di Triton-X 100 (1x PBST), invertendo delicatamente i tubi della microfuga 5-6 volte. Quindi, procedere con quattro lavaggi di 10-15 minuti (lavaggio lungo) con 1 mL di 1x PBST (40-60 minuti totali).
    NOTA: Si consiglia di utilizzare 1x PBS + 0,1% Triton-X 100 per i lavaggi poiché l'aumento della percentuale di detergente potrebbe comportare la denaturazione della GFP, portando a una diminuzione della fluorescenza e al rilevamento di proteine BM marcate con GFP.
11. Per la colorazione del colorante, ad esempio la colorazione del DNA e della F-actina, procedere alla fase 3. Per l'immunocolorazione, procedere al passaggio 4. Le ovaie possono essere conservate in 1x PBST a 4 °C per un massimo di 24 ore prima di procedere.

3. Colorazione standard di DNA/F-actina

1. Dopo la fissazione e il lavaggio, rimuovere PBST. Aggiungere 500 μL di DNA e soluzione colorante F-Actina. Per preparare la soluzione di DNA/F-Actina, mescolare Hoechst (colorazione del DNA; diluizione 1:1000 della soluzione madre da 1 mg/mL) e falloidina marcata con fluoroforo (colorazione F-actina; diluizione 1:500 per Alexa Fluor 546 o diluizione 1:100 per Alexa Fluor 647, ciascuna delle soluzione madre da 66 μM) in 500 μL di PBST.
2. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per mantenere le ovaie e i coloranti al buio per mantenere la fluorescenza per un imaging efficiente e incubare su un bilanciere a piattaforma nutating per 15 minuti.
3. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di DNA/F-actina (come nel passaggio 2.9). Eseguire due lavaggi rapidi e tre lavaggi lunghi (10-15 minuti) in 1x PBST come descritto nel passaggio 2.10. Procedere al montaggio come descritto nel passaggio 5.

4. Immunocolorazione fluorescente

NOTA: Questo è un protocollo immunocolorante standard per l'imaging fluorescente ed è compatibile con la maggior parte degli anticorpi primari.

1. Bloccante e immunocolorazione anticorpale primaria (Giorno 1)
   1. Dopo il fissaggio e il lavaggio, rimuovere PBST come descritto nel passaggio 2.9. Aggiungere 1 mL di soluzione bloccante (PBS + 5% BSA) e bloccare le ovaie su un bilanciere a piattaforma nutating per almeno 1 ora.
      NOTA: Oltre alla BSA, alla soluzione bloccante è possibile aggiungere siero bovino fetale (FBS) o siero di capra normale (NGS). In alternativa, le ovaie possono essere bloccate durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 °C.
   2. Rimuovere la soluzione bloccante come al punto 2.9 e aggiungere 300 μL di soluzione anticorpale primaria contenente anticorpi primari diluiti alle concentrazioni appropriate (specifiche per l'anticorpo utilizzato) nella soluzione bloccante. Incubare durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 °C. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale primaria e procedere all'immunocolorazione anticorpale secondaria.
      NOTA: Alcuni anticorpi primari possono essere salvati e riutilizzati. In alcuni casi, gli anticorpi primari riutilizzati possono ridurre la colorazione di fondo, con conseguente migliore imaging. Tuttavia, il riutilizzo dovrebbe essere testato per ciascun anticorpo per garantire l'efficienza.
2. Immunocolorazione anticorpale secondaria (Giorno 2)
   1. Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale primaria, eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi (10-15 minuti) come nel passaggio 2.10. Lavaggi ripetitivi eseguiti con cura utilizzando un NUOVO PBST 1x ridurranno lo sfondo non specifico e porteranno a un'imaging ottimale.
   2. Rimuovere PBST come nel passaggio 2.9 e aggiungere 500 μL di soluzione anticorpale secondaria contenente anticorpi secondari fluorescenti che rileveranno gli anticorpi primari utilizzati. Proteggi il tubo dalla luce coprendolo in un foglio di alluminio da questo punto in poi per una conservazione ottimale della fluorescenza, che è fondamentale per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
      NOTA: La soluzione anticorpale secondaria deve contenere anticorpi secondari coniugati con fluorofori che non si sovrappongono a proteine marcate endogenamente. Ad esempio, se si utilizzano proteine marcate con GFP, si raccomanda l'uso di anticorpi secondari Alexa Fluor a lunghezze d'onda rosse o rosso lontano (ad esempio, 546, 568 o 647 nm). I coloranti fluorescenti, come Hoechst e Alexa Fluor 546 o 647 falloidina coniugata, possono essere aggiunti alla soluzione secondaria. Queste macchie potrebbero essere utili per marcare la struttura cellulare complessiva (cioè nuclei e F-actina). Fare riferimento al passaggio 3.1 per le concentrazioni.
   3. Incubare le ovaie nella soluzione anticorpale secondaria su un bilanciere a piattaforma nutating per 2 ore a temperatura ambiente. Eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi (10-15 min) in 1x PBST come nel passaggio 2.10. Procedere al montaggio come nel passaggio 5.

5. Montaggio delle ovaie macchiate

NOTA: Questo metodo funziona molto bene se le ovaie sono ben sviluppate e abbondanti. Un attento montaggio delle ovaie sul vetrino è fondamentale per un'imaging ottimale.

1. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta p1000 per pipettare delicatamente le ovaie su e giù nel tubo per separare le camere delle uova. Lasciare che le camere delle uova affondino sul fondo mantenendo il tubo in posizione verticale per 5-10 minuti. Un'attenta separazione delle singole camere delle uova è fondamentale per ottenere un'acquisizione ottimale delle immagini.
2. Rimuovere PBST utilizzando un pipetto Pasteur, lasciando ~ 50 μL. Rimuovere il più possibile il PBST rimanente utilizzando una pipetta p200. Aggiungere due gocce di mezzo di montaggio, sufficienti per distribuire uniformemente su un coperchio di 22 mm x 22 mm. Le ovaie possono essere conservate in un mezzo di montaggio in tubi microcentrifugati a 4 °C fino a 1 mese prima del montaggio.
   NOTA: diversi supporti di montaggio sono disponibili in commercio; si consiglia di utilizzare montanti hard-setting, come Aqua-Poly/Mount o ProLong Glass Antifade Mountant, per ottenere condizioni di imaging ottimali. L'uso del glicerolo come mezzo di montaggio è scoraggiato poiché può portare a cattive condizioni di imaging (ad esempio, instabilità del fluoroforo). Per il montaggio di supporti che non polimerizzano, sigillare il coperchio utilizzando un sigillante per copricapedi/smalto per fissarlo in posizione.
3. Etichettare un vetrino e pulirlo con carta morbida e priva di polvere per rimuovere polvere e impronte digitali. Tagliare l'estremità di una punta della pipetta p200 per consentire un facile trasferimento del mezzo di montaggio viscoso alla slitta dal tubo microcentrifuga. Quindi, trasferire lentamente tutte le camere delle uova nel mezzo di montaggio sul vetrino, assicurandosi di non creare bolle.
4. Sotto un microscopio sezionante, stendere delicatamente il mezzo di montaggio e separare le camere delle uova utilizzando una nuova punta o pinza p200 per coprire un'area approssimativamente delle dimensioni del coperchio.
5. Usando una pinza, posizionare con attenzione il coperchio (pulito con carta priva di polvere) sulle camere delle uova ad angolo per evitare bolle.
6. Conservare la diapositiva a temperatura ambiente su una superficie piana al buio per 2 giorni per polimerizzare. Una volta che il supporto di montaggio è indurito, il vetrino può essere conservato a 4 °C al buio per alcune settimane per l'imaging.
   NOTA: è importante polimerizzare il mezzo di montaggio a presa dura prima dell'imaging. Se il mezzo non si è ancora polimerizzato, le ovaie fluttueranno sotto il coperchio, influenzando l'acquisizione dell'immagine. Inoltre, l'indice riflettente ottimale del supporto di montaggio si ottiene solo dopo che è stato completamente impostato (vedere le informazioni del produttore per i dettagli).
7. Metodo di montaggio alternativo: Questo metodo è raccomandato per ridurre la perdita di tessuto se le ovaie non sono abbondanti. In questo metodo (descritto di seguito), separare gli ovarioli e le camere delle uova sul vetrino durante il montaggio, invece di separarli in un tubo microcentrifuga mediante pipettaggio come descritto al punto 5.1.
   1. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere tutti tranne ~ 100 μL della soluzione di lavaggio. Utilizzando una pipetta Pasteur o una pipetta p1000, trasferire le ovaie intatte in PBS al vetrino. Utilizzando una pipetta p200, rimuovere con attenzione il maggior numero possibile di PBST dalla slitta. Utilizzare una carta priva di polvere per pulire il PBST, se necessario. Non toccare le ovaie.
   2. Aggiungere due gocce di supporto di montaggio. Separare accuratamente gli ovarioli e le camere delle uova usando pinze o aghi di dissezione. Rimuovere e scartare il tessuto estraneo, quindi distribuire le camere delle uova e gli ovarioli nel mezzo di montaggio. Procedere ai passaggi 5.5-5.6.

6. Acquisizione di immagini confocali

NOTA: questa sezione fornisce i parametri chiave per ottenere un'acquisizione ottimale delle immagini utilizzando qualsiasi microscopio confocale (Figura 2).

1. Impostare il microscopio e individuare il campione come descritto di seguito.
   1. Prima dell'imaging, è fondamentale individuare la regione di interesse (ROI) utilizzando l'oculare del microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (20x) o l'obiettivo da utilizzare per l'acquisizione di immagini (ad esempio, 40x o 63x). Selezionare una camera delle uova da visualizzare.
      NOTA: per l'acquisizione di immagini, si consiglia di utilizzare obiettivi di ingrandimento elevato come 40x o 63x (vedere 6.2.1).
   2. Una volta selezionato il ROI, procedere all'acquisizione delle immagini; procedere al passaggio 6.2 per l'imaging confocale e al passaggio 7 per l'imaging a super-risoluzione.
2. Selezionare i parametri chiave per l'acquisizione ottimale delle immagini come descritto di seguito (esempi di parametri chiave per le immagini rappresentative sono riportati nella Tabella 1).
   1. Selezione di un obiettivo: per l'acquisizione di immagini confocali del traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel FE, utilizzare un obiettivo 40x o 63x.
      NOTA: Per ottenere la migliore risoluzione possibile, l'uso di obiettivi Plan-Apochromat, con apertura numerica elevata (NA) che forniscono la massima correzione acromatica, è altamente raccomandato.
   2. Selezione dei laser per ogni canale/traccia: per GFP, utilizzare il laser a 488 nm; per DAPI o Hoechst, utilizzare laser 405 nm; per Alexa Fluor 546 o 568, utilizzare il laser 561 nm; e per Alexa Fluor 647, utilizzare laser 640 nm.
      NOTA: ogni selezione laser comporterà una diversa formazione di canale/traccia. Qui, il termine canale si riferisce all'immagine formata dalla distribuzione dell'intensità registrata per i fluorofori eccitati per il ROI selezionato alla lunghezza d'onda specifica di ciascun canale.
   3. Impostazione stenopeico: per ridurre la luce sfocata durante l'acquisizione dell'immagine, impostare il foro stenopeico per ciascun canale su 1 UA.
   4. Impostazioni dell'intensità del laser e del guadagno del rilevatore: per ottimizzare la sensibilità dell'immagine, utilizzare sia il guadagno principale del rilevatore che la potenza del laser. Per impostare correttamente la sensibilità dell'immagine, si consiglia un indicatore di intervallo. Impostare sia il guadagno principale che la potenza del laser per avere una sensibilità adeguata in cui le strutture di interesse (ad esempio, vescicole contenenti BM) sono chiaramente visibili evitando la saturazione del rilevatore.
      NOTA: per evitare il fotosbiancamento, utilizzare la potenza laser minima necessaria. Si consiglia di aumentare prima il guadagno del rilevatore utilizzando la potenza laser più bassa possibile. Se un aumento del guadagno del rilevatore non può raggiungere l'intensità desiderata, aumentare la potenza del laser. Si raccomanda un'intensità di potenza laser compresa tra lo 0,5% e l'1,2%.
   5. Dimensione del fotogramma: si consiglia di utilizzare la dimensione ottimale dell'immagine determinata dal software di acquisizione. Per la maggior parte delle applicazioni, utilizzare una risoluzione massima di 1024 x 1024. Una risoluzione più elevata aumenterà significativamente il tempo di acquisizione.
   6. Velocità di scansione: utilizzare una velocità di scansione compresa tra 6 e 9, che è sicura per la maggior parte dei campioni. Se il campione è rumoroso, utilizzare una velocità di scansione più lenta per migliorare il rapporto segnale/rumore. Tuttavia, le basse velocità di scansione aumentano il tempo di fotosbiancamento e acquisizione.
   7. Media dell'intensità: per migliorare la qualità dell'immagine, utilizzare la media dell'intensità media tramite scansioni successive con impostazioni identiche. Per la maggior parte dei casi, utilizzare una media di due per migliorare i rapporti segnale-rumore senza fotosbiancare il campione.
   8. Zoom: regola l'area di scansione utilizzando la funzione zoom. Usa uno zoom tra 2x-4x con obiettivi 40x e 63x come valore più efficace per visualizzare chiaramente le vescicole contenenti BM nella FE. Seleziona attentamente il ROI minimo per ridurre i tempi di acquisizione.
3. Per acquisire uno z-stack utilizzando il software Zeiss Zen, utilizzare i seguenti parametri Z-sectioning e impostarli come descritto di seguito.
   NOTA: Le vescicole e altre strutture intracellulari contenenti proteine BM sono strutture tridimensionali (3D). L'acquisizione di uno z-stack attraverso la FE migliorerà significativamente la qualità e la risoluzione dell'immagine. Di solito, un intervallo che copre lo spessore / profondità del tessuto è sufficiente per visualizzare in modo efficiente la localizzazione intracellulare. Per una ricostruzione 3D ottimale, si consiglia di utilizzare l'intervallo ottimale determinato dal software. Per obiettivi 40x e 63x, evitare intervalli superiori a 0,5 μm tra ogni sezione z per consentire una ricostruzione 3D ottimale.
   1. Fare clic sulla casella di controllo z-Stack nell'area principale della scheda Acquisizione . Selezionare la modalità di scansione Tutte le tracce per sezione per z-stack. Ciò comporterà un cambiamento nelle tracce di canale per ogni fetta di posizione z.
   2. Selezionare il canale desiderato per osservare il campione e fare clic su Live per avviare una scansione dal vivo. Si raccomanda l'uso del canale necessario per rilevare la proteina BM con tag GFP.
   3. Impostare un intervallo per lo z-stack come descritto. Utilizzando la manopola di regolazione fine sul microscopio, trovare la posizione z per un'estremità del campione e fare clic su Imposta prima. Allo stesso modo, trova la posizione z per l'altra estremità del campione e fai clic su Imposta ultimo.
   4. Per ogni posizione nello z-stack, fare clic su ciascun canale separatamente con l'indicatore di intervallo selezionato e regolare l'intensità del laser e il guadagno principale in base alle esigenze, come descritto nel passaggio 6.2.4.
   5. Impostare l'intervallo per lo z-stack per assegnare la dimensione del passo come consigliato nella NOTA sotto il passaggio 6.3. Fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione z-stack.

7. Acquisizione di immagini a super-risoluzione

1. Selezionare un obiettivo compatibile con Airyscan. Per visualizzare la localizzazione intracellulare della proteina BM, l'uso di un obiettivo di olio 63x è ottimale (Figura 3). Impostare l'obiettivo su 63x e posizionare delicatamente una goccia di olio per immersione sulla lente. Posizionare la diapositiva sull'obiettivo con la slitta di copertura rivolta verso l'obiettivo per individuare il campione.
2. Selezionare una configurazione con le impostazioni appropriate per il fluoroforo all'immagine come descritto di seguito.
   1. Fare clic sul pulsante Smart Setup nella scheda Acquisizione per configurare un nuovo esperimento. Selezionare Airyscan (super-risoluzione); quando questa opzione è selezionata, sarà necessaria un'ulteriore selezione tra Risoluzione (Airyscan SR), SNR/sensibilità (Airyscan Confocal) e Velocità (Multiplex SR-2Y). Per il tessuto fisso, selezionare Risoluzione in quanto ciò si tradurrà nella migliore acquisizione.
   2. Fai clic su + nella casella Configura il tuo esperimento per aggiungere tracce/canali. Selezionare le tracce per coloranti specifici dal database dei coloranti. Per un esperimento multicanale, aggiungi ogni traccia secondo necessità selezionando i coloranti appropriati.
   3. Dopo aver aggiunto tutte le tracce, selezionare una delle proposte di esperimento fornite dal software. Per questo esperimento, utilizzare Best Signal, poiché sebbene la velocità sarà un po 'più lenta rispetto alla proposta Smartest (Line), creerà le migliori impostazioni hardware per ogni colorante, con conseguente massimo guadagno del segnale e diafonia di emissione minima. Una volta che l'esperimento è stato impostato e caricato, verrà visualizzato nella finestra Impostazione imaging nella scheda Acquisizione.
   4. Una volta selezionata una configurazione intelligente, verrà automaticamente selezionata la gamma di lunghezze d'onda per il rilevatore GaAsP-PMT. Regolare l'intervallo spostando la barra di scorrimento nella parte inferiore per aumentare o diminuire l'intervallo o spostare completamente l'intervallo in un'altra regione in base alle esigenze. Utilizzare questa opzione per assicurarsi che gli intervalli di due canali diversi non si sovrappongano per evitare la diafonia. Salvare la configurazione per riutilizzarla in futuro.
3. Una volta impostata la configurazione, procedere alla regolazione dello zoom e dell'area di scansione come nel passaggio 6.2.8. Ottimizza l'area di scansione per concentrarti sulla regione di interesse per ridurre i tempi di scansione e lo spazio di archiviazione. Procedere all'acquisizione delle immagini.
4. Per ogni singolo canale, seleziona una traccia sotto Canale e fai clic su Live. Regolare il guadagno principale e la potenza del laser utilizzando lo strumento indicatore di intervallo come descritto nel passaggio 6.2.4 e seguire tutte le linee guida descritte per evitare pixel saturi. Verificare che la vista esagonale del rilevatore sia centrata e allineata facendo clic sul pulsante Airyscan Detector View . Nella maggior parte dei casi, la vista esagonale del rilevatore viene automaticamente centrata e allineata. Ripetere l'operazione per altri canali.
5. Nella finestra di commutazione della modalità di acquisizione, in Dimensioni immagine, fare clic su SR (conteggio pixel limitato a super-risoluzione) per massimizzare le capacità del rilevatore. Questo regolerà automaticamente le dimensioni del fotogramma.
6. Mantenere la media su Nessuno in quanto di solito non è necessario e questo ridurrà il tempo di scansione. In alcuni casi, una media di 2x può migliorare il rapporto segnale-rumore.
7. Raccogli dati grezzi con profondità di dati a 8 bit. Clicca su Snap per acquisire un'immagine. Per acquisire uno z-stack, seguire il passaggio 6.3.
8. Eseguire l'elaborazione delle immagini come descritto di seguito. Questo produrrà un'immagine a 16 bit.
   1. Una volta ottenuta l'immagine o z-stack, fare clic su Metodo di elaborazione > e selezionare Elaborazione Airyscan.
   2. Eseguire il filtro automatico per iniziare ed eseguire un'ulteriore elaborazione manuale modificando il valore SR per ottenere i migliori risultati per il campione. Una volta determinato il valore SR ottimale, fare clic su Applica per generare un'immagine elaborata. Nel caso di immagini z-stack, elaborare come una z-slice (Current Image [2D]) o come l'intero z-stack facendo clic sulla casella Elaborazione 3D .

8. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati (proiezione ortogonale, ricostruzione 3D e profilo di intensità)

NOTA: per questo metodo, i passaggi utilizzati per generare proiezioni ortogonali, ricostruzioni 3D e profili di intensità sono descritti per il software Zen (vedere Tabella dei materiali). Analisi di dati simili possono essere eseguite anche con il software ImageJ⁵⁶.

1. Eseguire la proiezione ortogonale come descritto di seguito (Figura 4).
   1. Una volta ottenuto uno z-stack utilizzando la microscopia confocale o a super-risoluzione, generare una proiezione ortogonale per visualizzare le vescicole nell'asse z della cella in una vista 2D (rispetto alla ricostruzione 3D). Per fare ciò, fare clic su Metodo di > di elaborazione e selezionare Proiezione ortogonale.
   2. In Parametri (Parameters), selezionate il piano di proiezione richiesto. Per una proiezione dell'asse z (z-stack), selezionate il piano frontale (XY ). In Metodo selezionare Massimo per ottenere la massima qualità di proiezione.
   3. Quindi, determinare lo spessore della proiezione selezionando la posizione iniziale (z-slice iniziale) e determinare lo spessore (numero totale di z-slice) nella proiezione. È ideale selezionare lo spessore uguale a quello di una cella nell'asse z.
   4. Una volta impostati i parametri, fare clic su Applica per creare la proiezione dello z-stack in modo XY.
      NOTA: quando si creano proiezioni ortogonali di più z-stack per confrontare la quantità di un particolare oggetto di interesse, è imperativo mantenere lo spessore della proiezione uguale (o il più vicino possibile) per l'accuratezza dei dati.
2. Eseguire la ricostruzione 3D come descritto di seguito (Figura 5).
   1. Crea ricostruzioni 3D di z-stack per osservare la localizzazione e la forma delle strutture. Fallo per z-stack acquisiti utilizzando approcci confocali e super-risoluzione. Elabora gli z-stack a super-risoluzione utilizzando prima l'elaborazione 3D come nel passaggio 7.8 per la ricostruzione 3D.
   2. Per generare un'immagine 3D, fare clic sull'icona 3D nella finestra di anteprima. Una volta cliccato, una scheda 3D apparirà nella sezione di controllo del display nella metà inferiore dello schermo. Le viste 3D, ad esempio Trasparenza, Volume, Massimo, Superficie e Misto, saranno visibili. Utilizzate le viste Superficie o Misto quando visualizzate la struttura delle vescicole (preferibilmente).
   3. Per un'immagine di qualità superiore, selezionare l'impostazione Precisa , poiché l'impostazione più veloce sarà meno accurata e porterà a un rendering 3D scadente.
   4. Una volta generata l'immagine, manipolala ruotandola e ingrandendola per mettere a fuoco una posizione preferita per visualizzare gli oggetti di interesse. Manipolare l'immagine 3D nella scheda Aspetto .
   5. Una volta ottenuta una vista soddisfacente, nella scheda 3D selezionare Risoluzione visualizzata, quindi fare clic su Crea immagine. Questo creerà un'istantanea dell'immagine nello stesso orientamento in cui è stata visualizzata e può essere salvata ed esportata in vari formati di file.
3. Generare un profilo di intensità come descritto di seguito (Figura 7).
   NOTA: i profili di distribuzione e intensità dei pixel associati ai diversi segnali fluorescenti possono essere visualizzati come un'immagine sovrapposta per determinarne la colocalizzazione.
   1. Una volta acquisita un'immagine ottimale tramite imaging confocale o a super-risoluzione, nel pannello Visualizza della finestra Anteprima , fare clic su Profilo. Nella finestra di anteprima, apparirà un istogramma che mostra il profilo di intensità in funzione della distanza, nonché una tabella che mostra le distanze e i valori di intensità.
   2. Nell'area dei controlli di visualizzazione nella parte inferiore dello schermo, fare clic sullo strumento freccia nella scheda Definizione profilo . Disegna una freccia lungo la lunghezza dell'oggetto per il quale è necessario valutare il profilo di intensità dei diversi pixel. Per disegnare la freccia, ingrandisci l'immagine.
   3. Il profilo di intensità apparirà a sinistra dell'anteprima dell'immagine, dove verranno visualizzati la distanza e i picchi corrispondenti lungo il percorso della freccia. Per rimuovere l'istogramma visualizzato sull'immagine stessa, deselezionare la casella Mostra profilo in grafica .
   4. Nella scheda Dimensioni nell'area di controllo dello schermo, deselezionate tutti i canali che non devono essere inclusi nel profilo di intensità.
   5. Nella scheda Grafica , fare doppio clic su Profilo mostrato nella casella Annotazioni/Misure per aprire la finestra a comparsa Formato elementi grafici . Utilizzatelo per modificare il colore della freccia, nonché lo stile e lo spessore del tratto. Chiudere la casella dopo aver selezionato le impostazioni desiderate.
   6. Fare clic sulla scheda Visualizzazione profilo . Nella sezione nuova immagine, fare clic su Visualizzazione corrente e quindi su Salva con nome per salvare il file. Si consiglia di salvare il file come file .tif per evitare la compressione e la perdita di dati.

Representative Results

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell'ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere ottenuti con altre proteine BM marcate endogenamente come Pcan-GFP.

Impostazione dei parametri di acquisizione ottimali (Figura 2)
Per caratterizzare con precisione il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM, come Vkg e Pcan, nelle cellule epiteliali, è fondamentale impostare correttamente i parametri di acquisizione del microscopio confocale come descritto nei metodi forniti.

Utilizzando la microscopia confocale, la localizzazione intracellulare di Vkg-GFP può essere rilevata prima di essere secreta e depositata basalmente nella FE (Figura 2A). È stato dimostrato che dopo la traduzione in pronto soccorso, Coll IV viene trasportato al Golgi prima di essere confezionato in vescicole esocitiche intracellulari. Utilizzando questo approccio di imaging, osserviamo che Vkg-GFP si accumula in compartimenti intracellulari con forme diverse, potenzialmente rappresentando diversi organelli, compartimenti endosomiali e tipi di vescicole (Figura 2A, frecce). Nelle vescicole esocitiche, Coll IV è già assemblato in fibrille composte da tre polipeptidi: due catene α1 e una catena α2 (Vkg in Drosophila), portando alla formazione di vescicole allungate che possono anche essere visualizzate utilizzando l'imaging confocale (Figura 2A, frecce). Quindi, Coll IV viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali dove viene depositato nel BM (Figura 2, punte di freccia).

Se i parametri di acquisizione non sono impostati correttamente, non è possibile osservare con precisione le diverse morfologie e posizioni durante il traffico intracellulare di proteine BM (Figura 2B,C). Ad esempio, se i parametri di acquisizione sono ottimizzati per visualizzare il BM extracellulare e non le strutture intracellulari, i compartimenti e le vescicole endosomiali contenenti proteine BM (qui contrassegnati da Vkg-GFP) appaiono deboli o non sono visibili (Figura 2B). Al contrario, se i rivelatori sono eccessivamente saturi, la localizzazione intracellulare di Vkg-GFP può essere rilevata come nella condizione ottimale (confrontare Figura 2A e Figura 2C), ma un aumento del rumore di fluorescenza di fondo rende più difficile l'interpretazione della localizzazione della proteina BM, in particolare per gli esperimenti di colocalizzazione (vedi Figura 7 ). Nel complesso, questi dati illustrano l'importanza di parametri di acquisizione adeguati per ottenere una localizzazione accurata delle proteine BM nell'epitelio.

Impostazione dei parametri ottimali di super-risoluzione e deconvoluzione (Figura 3)
Come illustrato per l'acquisizione di immagini confocali, è anche fondamentale impostare correttamente i parametri di acquisizione quando si utilizza la microscopia a super-risoluzione per evitare una sotto- o sovra-saturazione. Questo approccio di imaging a super-risoluzione comporta anche l'attenta configurazione dei parametri di deconvoluzione per ottenere l'imaging a super-risoluzione (Figura 3). Quando l'elaborazione della deconvoluzione è configurata in modo ottimale, l'imaging a super-risoluzione aumenta significativamente la risoluzione delle strutture intracellulari contenenti proteine BM (Figura 3A, frecce), come vescicole o strutture di Golgi (Figura 3A e Figura 7C), il BM stesso (Figura 3A, punte di freccia) e migliora il rapporto segnale-rumore⁴⁵ . La microscopia a super-risoluzione porta ad un aumento di circa 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali rispetto alla microscopia confocale. Questo aumento di risoluzione è chiaramente illustrato dalle immagini meglio definite del traffico intracellulare di proteine BM e del BM prese utilizzando l'imaging a super-risoluzione rispetto a quelle prese con CSLM standard (confronta Figura 2A e Figura 3A).

Se i parametri di deconvoluzione non sono impostati correttamente, la super-risoluzione non viene raggiunta in modo ottimale e l'aumento della risoluzione viene perso. La sotto-elaborazione delle immagini a super-risoluzione porta a immagini sfocate, con conseguente localizzazione intracellulare delle proteine BM che appaiono deboli e non così ben definite come in condizioni ottimali (confrontare la Figura 3B con la Figura 3A). Al contrario, l'eccessiva elaborazione delle immagini porta a immagini sgranate, in cui la localizzazione intracellulare delle proteine BM appare pixelata (Figura 3C). Questi dati evidenziano l'importanza di utilizzare parametri di deconvoluzione adeguati per ottenere immagini significative e rappresentative che riflettano la distribuzione intracellulare delle proteine BM.

Complessivamente, questi dati mostrano chiaramente ed evidenziano la migliore risoluzione del traffico intracellulare di proteine BM utilizzando l'elaborazione delle immagini a super-risoluzione rispetto alla microscopia confocale. In particolare, questo approccio consente una migliore visualizzazione del traffico intracellulare di proteine BM migliorando la risoluzione delle strutture intracellulari coinvolte. Ciò consente il confronto di diverse dimensioni e forme di strutture per identificare e caratterizzare meglio nuovi fattori coinvolti nella deposizione polarizzata delle proteine BM nel FE.

Proiezione ortogonale e ricostruzione 3D di sezioni z ottiche (z-stack) attraverso il FE per migliorare la visualizzazione della distribuzione intracellulare delle proteine BM (Figura 4 e Figura 5)
Poiché la distribuzione intracellulare delle proteine BM è presente in tutto il FE in 3D (assi x, y e z), la proiezione ortogonale e/o la ricostruzione 3D delle sezioni z ottiche attraverso la FE, utilizzando la super-risoluzione o la microscopia confocale, possono essere utilizzate per valutare la localizzazione e la distribuzione delle proteine BM all'interno di cellule wild-type o mutanti (ad esempio, in Figura 4 e Figura 5).

La proiezione ortogonale consente di proiettare tutte le sezioni z acquisite su un unico piano. Questo metodo è particolarmente utile per mostrare la distribuzione complessiva di vescicole e compartimenti contenenti proteine BM in una singola immagine utilizzando l'imaging confocale (Figura 4A) o super-risoluzione (Figura 4B). Tuttavia, una risoluzione significativamente migliore e un minore rumore di fondo risultano quando si utilizza la microscopia a super-risoluzione rispetto alla microscopia confocale (confrontare figura 4B e figura 4A).

Un altro approccio per visualizzare la distribuzione complessiva dei compartimenti e delle vescicole contenenti BM è quello di generare una ricostruzione 3D assemblando una pila di sezioni ottiche z prese mediante imaging confocale (Figura 5A) o super-risoluzione (Figura 5B). Questo approccio può anche essere molto efficace per valutare la localizzazione e la distribuzione delle proteine BM intracellulari e la forma dei compartimenti e delle vescicole contenenti Vkg-GFP, in particolare quando si utilizza la microscopia a super-risoluzione (Figura 5). La microscopia confocale tradizionale (Figura 5A) si traduce in un rumore di fondo più elevato rispetto alla super-risoluzione (Figura 5B), che se viene preso in considerazione nel rendering 3D può causare artefatti. Inoltre, la minore risoluzione delle confocali fa sì che le immagini create siano meno fluide e definite rispetto a quelle generate dalla super-risoluzione (confronta figura 5A e figura 5B).

Caratterizzazione dei fenotipi associati alla perdita di componenti coinvolti nella secrezione polarizzata di proteine BM mediante imaging a super-risoluzione (Figura 6)
Come mostrato finora (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5), la microscopia a super-risoluzione e l'elaborazione delle immagini possono essere utilizzate per valutare la localizzazione intracellulare e la distribuzione delle proteine BM nel wildtype FE dell'ovaio Drosophila . Inoltre, questo approccio può essere utilizzato anche per determinare e confrontare la localizzazione di proteine BM in condizioni mutanti o knockdown. Questo, quindi, è un metodo efficace per caratterizzare il ruolo (i) dei componenti appena identificati dedicati al traffico intracellulare polarizzato, alla secrezione e alla deposizione di proteine BM.

Il fattore di scambio GTPasi (GEF) Crag ha dimostrato di essere un componente chiave in un percorso biologico dedicato alla deposizione polarizzata delle proteine BM²⁸. Nelle FC knockdown di Crag , le proteine BM si accumulano sia apicalmente che basalmente, indicando che Crag controlla la secrezione polarizzata di proteine BM come Vkg-GFP (Figura 6). L'uso della microscopia a super-risoluzione consente una migliore caratterizzazione del fenotipo risultante dalla perdita di Crag. Ad esempio, un forte accumulo apicale di proteine BM, così come l'organizzazione del BM apicale ectopico, si osserva nelle FC di Crag-knockdown (Figura 6B, punte di freccia). Inoltre, quando il fenotipo è meno aberrante, viene rilevata la membrana BM che si accumula apicalmente in piccole chiazze nelle FC (Figura 6B, frecce). Complessivamente, questi dati illustrano che la microscopia a super-risoluzione può essere utilizzata per caratterizzare i fenotipi mutanti per comprendere meglio i ruoli dei componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM.

Esperimento di colocalizzazione con anticorpi e proteine BM con tag endogeni ripresi con microscopia confocale e super-risoluzione (Figura 7)
Infine, l'uso di anticorpi contro specifici marcatori intracellulari o componenti appena identificati combinati con proteine BM marcate endogenamente può essere utilizzato per caratterizzare meglio il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nell'epitelio polarizzato. GM-130, un marcatore cis-Golgi, è usato per illustrare questo punto. Prima di essere confezionato in vescicole di secrezione, Coll IV viene trasportato al Golgi. Quando la distribuzione subcellulare di Vkg-GFP viene valutata utilizzando l'imaging confocale (Figura 7A, B) o super-risoluzione (Figura 7C, D), entrambi gli approcci mostrano che Vkg-GFP co-localizza parzialmente con GM-130, confermando che Coll IV è ordinato al Golgi prima della secrezione. Tuttavia, si osserva un aumento del rapporto segnale-rumore e una migliore risoluzione della colocalizzazione tra Vkg-GFP e GM130 quando si utilizza l'imaging a super-risoluzione (confrontare la Figura 7A con la Figura 7C).

Inoltre, quando la distribuzione spaziale e i livelli di pixel verdi (Vkg-GFP) e rossi (GM-130) vengono quantificati misurando l'intensità di fluorescenza di una sezione ottica attraverso FC presi con microscopia confocale (Figura 7B) e super-risoluzione (Figura 7D), si osserva la colocalizzazione di Vkg-GFP e GM-130. La distribuzione dei pixel Vkg-GFP e GM-130 è tracciata in istogrammi in cui le sovrapposizioni dei picchi Vkg-GFP e GM-130 indicano la loro colocalizzazione (Figura 7B',D'). Pertanto, utilizzando questo strumento di analisi delle immagini, è possibile determinare con precisione la posizione di Vkg-GFP in specifici compartimenti intracellulari. Tuttavia, il confronto degli istogrammi generati da immagini confocali (Figura 7B') con immagini a super-risoluzione (Figura 7D') conferma che la microscopia a super-risoluzione produce risultati migliori, come si può vedere dalla maggiore intensità dei picchi e dal ridotto rumore di fondo rappresentato dalla mancanza di picchi più piccoli (confronta Figura 7B' e Figura 7D' ) associati a istogrammi generati da super-risoluzione. Complessivamente, questi dati evidenziano che, sebbene la microscopia confocale possa essere utilizzata per quantificare la colocalizzazione, la super-risoluzione è un approccio più potente, che porta a una quantificazione più efficiente e precisa della localizzazione.

Figura 1: L'epitelio follicolare (FE) dell'ovaio Drosophila : un sistema modello per studiare la deposizione polarizzata delle proteine della membrana basale (BM). (A) Immagine di ovaie intatte dopo dissezione ed escissione presa con uno stereomicroscopio a fluorescenza. Le ovaie esprimono una proteina BM endogena marcata con GFP (Vkg-GFP). Barra della scala = 1 mm. (A') Due ovaie di una mosca femmina sono attaccate all'ovidotto. Ogni ovaia contiene 16-20 ovarioli. Un singolo ovariole è delineato (rettangolo). Barra di scala = 1 mm. (B) Sezione longitudinale, prelevata con un microscopio confocale, attraverso un ovariole che esprime Vkg-GFP e colorata per DNA (blu) e F-Actina (rosso). Gli ovarioles sono costituiti da camere d'uovo in diverse fasi. Le camere degli ovuli sono composte da un epitelio follicolare monostrato (FE) che circonda le cellule germinali (GC). Il FE sintetizza e secerne basalmente proteine BM (ad esempio, Pcan e Vkg). Barra di scala = 100 μm. (C) Schema della FE. Il FE è un epitelio classico con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso le cellule germinali e il dominio basale è rivolto verso il BM (verde). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Imaging del traffico intracellulare di proteine BM utilizzando l'imaging confocale. (A-C) Sezione longitudinale attraverso una camera dell'uovo che esprime Vkg-GFP (verde) e colorata per DNA (blu) e F-Actina (rosso). (A'-C') I compartimenti intracellulari e le vescicole contenenti Vkg-GFP (frecce) e il BM depositato basalmente ed extracellulare (punte di freccia) sono mostrati usando la microscopia confocale. (A) Immagine acquisita in modo ottimale per la quale è visibile il traffico intracellulare di Vkg-GFP. (A') Vkg-GFP è localizzato in tutto il citoplasma delle FC in diversi compartimenti cellulari (ad esempio, Golgi) e nelle vescicole. A causa dell'organizzazione delle fibrille di Collagen IV, le vescicole contenenti Vkg-GFP appaiono allungate (frecce). (B) Immagine sottoesposta per la quale i parametri di acquisizione sono ottimizzati per visualizzare il BM extracellulare e non la distribuzione intracellulare delle proteine BM. Vkg-GFP (verde) appare debole in tutto il citoplasma (B'), con conseguente vescicole contenenti Vkg-GFP non rilevabili rispetto a (A). (C) Immagine sovraesposta per la quale il rivelatore GFP è saturo, con conseguente aumento della fluorescenza di fondo. Sebbene la distribuzione intracellulare di Vkg-GFP (verde) possa essere vista localizzata in tutto il citoplasma delle FC (frecce), la sovraesposizione si traduce in artefatti di imaging in cui le strutture intracellulari appaiono più grandi di quanto non siano, come in (A-A'). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging del traffico intracellulare di proteine BM utilizzando l'imaging e l'elaborazione a super-risoluzione. (A-C) Sezione longitudinale attraverso una camera d'uovo che esprime Vkg-GFP (verde) e colorata per DNA (blu) e F-Actina (rosso). (A) Immagine a super-risoluzione elaborata in modo ottimale, in cui si osserva chiaramente il traffico intracellulare di Vkg-GFP. (A') Vkg-GFP è localizzato in tutto il citoplasma delle FC in diversi compartimenti cellulari (ad esempio, Golgi) e vescicole (frecce) e al BM (punte di freccia). (B) Immagine sotto-elaborata con conseguente fluorescenza di fondo più elevata rispetto a (A). La localizzazione intracellulare di Vkg-GFP (verde) appare debole e meno definita (confronta B con A). (C) Immagine sovra-elaborata con conseguente immagine in cui la localizzazione intracellulare di Vkg-GFP appare pixelata e granulosa. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Proiezione ortogonale di uno z-stack acquisito ed elaborato utilizzando approcci di microscopia confocale e super-risoluzione. (A-B) Proiezione ortogonale di sezioni z ottiche attraverso una camera d'uovo che esprime Vkg-GFP (verde) e colorata per DNA (blu) e F-Actina (rosso) usando microscopia confocale (A) o super-risoluzione (B). (A) Proiezione di uno z-stack acquisito utilizzando parametri confocali ottimali. La localizzazione intracellulare di Vkg-GFP può essere osservata attraverso l'asse z nelle FC (A', frecce). Anche il BM è visibile e appare molto luminoso (A', punte di freccia). (B) Proiezione di uno z-stack acquisito utilizzando un'elaborazione ottimale a super-risoluzione. Compartimenti intracellulari ben definiti e vescicole contenenti Vkg-GFP possono essere osservati attraverso l'asse z nelle FC (B', frecce). Il BM è anche molto ben definito (B', punte di freccia). La differenza tra l'imaging confocale standard e l'imaging a super-risoluzione è evidente, poiché la localizzazione intracellulare di Vkg-GFP e BM è significativamente più definita quando si utilizza la super-risoluzione rispetto alla microscopia confocale standard. Inoltre, l'immagine scattata al microscopio confocale ha una fluorescenza di fondo più elevata. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Ricostruzione 3D di uno z-stack acquisito ed elaborato utilizzando approcci di microscopia confocale e super-risoluzione. (A-B) Rendering 3D di z-stack (vista mista) di camere di uova che esprimono Vkg-GFP (verde) e colorate per DNA (blu) e F-actina (rosso). (A) Rendering 3D di uno z-stack acquisito tramite microscopia confocale. La posizione e la forma dei compartimenti e delle vescicole contenenti Vkg-GFP possono essere viste in tutte le cellule (A'). (B) Rendering 3D di uno z-stack acquisito tramite elaborazione ottimale a super-risoluzione. La posizione e la forma dei compartimenti e delle vescicole contenenti Vkg-GFP possono essere viste (B'). La forma delle vescicole, così come il BM e i nuclei, sono definiti senza intoppi e la risoluzione è superiore a quella della microscopia confocale (rispetto a B' e A'). La forma e le dimensioni dei compartimenti e delle vescicole contenenti Vkg-GFP possono anche essere meglio determinate utilizzando la microscopia a super-risoluzione (rispetto a B' e A'). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Caratterizzazione della localizzazione Vkg-GFP in FC abbattuti da Crag. (A-B) Sezione longitudinale attraverso una camera d'uovo che esprime Vkg-GFP (verde), colorata per DNA (blu) e F-Actina (rosso) e acquisita tramite elaborazione ottimale a super-risoluzione. (A) Linea di controllo che esprime il wildtype Crag, una proteina critica per una corretta deposizione di BM. La FE mostra la tipica localizzazione della proteina BM, in cui Vkg-GFP è distribuito intracellulare e depositato basalmente nel FE (A'). (B) Linea transgenica di Drosophila che esprime RNAi per Crag nella FE, con conseguente abbattimento di Crag. La perdita di Crag porta alla cattiva localizzazione delle proteine BM (ad esempio, Vkg-GFP) apicalmente nel FE (B', frecce e punte di freccia). L'immagine a super-risoluzione viene utilizzata per caratterizzare i fenotipi di mislocalizzazione BM associati alla perdita di Crag. Nello specifico, alcuni Crag RNAi FC, mostrano una forte mislocalizzazione apicale delle proteine BM (B', punte di freccia), mentre altri Crag RNAi FC presentano una più debole mislocalizzazione apicale (B', frecce). L'imaging a super-risoluzione rivela chiaramente i fenotipi associati alla perdita di Crag (B', punte di freccia vs frecce). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Colocalizzazione di Vkg-GFP e GM-130 (marcatore di Golgi) utilizzando approcci al microscopio confocale e super-risoluzione. (A-D) Sezioni longitudinali attraverso camere d'uovo che esprimono Vkg-GFP e immunocolorate per un marcatore cis-Golgi (GM-130, rosso), fotografate utilizzando microscopia confocale (A,B) o super-risoluzione (C,D). (A,B) L'imaging confocale mostra che la Vkg-GFP intracellulare si colocalizza parzialmente con un marcatore cis-Golgi (A, punta di freccia). (B) Area ingrandita di (A). Le distribuzioni dei pixel verdi (Vkg-GFP) e rossi (GM-130) lungo la freccia bianca sono tracciate in un istogramma (B'). L'asse x dell'istogramma rappresenta la distanza (μm) lungo la freccia mentre l'asse y rappresenta l'intensità dei pixel. I picchi verdi e rossi sovrapposti (*) mostrano dove Vkg-GFP e GM-130 colocalizzano. (C,D) L'imaging a super-risoluzione mostra anche che la Vkg-GFP intracellulare si colocalizza parzialmente con un marcatore cis-Golgi (C, punta di freccia). (D) Area ingrandita di (C). Le distribuzioni dei pixel verdi (Vkg-GFP) e rossi (GM-130) lungo la freccia bianca sono tracciate in un istogramma (D'). L'asse x dell'istogramma rappresenta la distanza (μm) lungo la freccia mentre l'asse y rappresenta l'intensità dei pixel. I picchi verdi e rossi sovrapposti (*) mostrano dove Vkg-GFP e GM-130 colocalizzano. Questi dati mostrano che l'imaging a super-risoluzione è un approccio più efficiente e preciso rispetto all'imaging confocale per caratterizzare e quantificare la colocalizzazione. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Parametri di acquisizione ed elaborazione della microscopia confocale e super-risoluzione per le immagini rappresentative. Tutti i principali parametri di imaging sono compilati per le immagini rappresentative fornite. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d'organo e per le funzioni fisiologiche dell'adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l'istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto². Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un'attenta analisi dei componenti di queste vie e del loro ruolo nell'elaborazione del BM. Un modo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare l'imaging confocale e super-risoluzione. Qui, abbiamo descritto i metodi per la preparazione e la colorazione o l'immunocolorazione delle ovaie di Drosophila per visualizzare in modo efficiente il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nella FE utilizzando la microscopia confocale e a super-risoluzione.

Vantaggi della trappola proteica e delle proteine marcate endogenamente per visualizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in condizioni wild-type e mutanti
Il protocollo fornito sfrutta appieno le trappole proteiche e le proteine BM marcate endogenamente (ad esempio, Vkg-GFP e Pcan-GFP) per visualizzare e valutare la localizzazione e la distribuzione delle proteine BM nella FE in condizioni wild-type (controllo) e mutanti. Queste linee hanno importanti vantaggi rispetto all'uso di anticorpi contro le proteine BM. In primo luogo, gli anticorpi contro specifiche proteine di interesse sono spesso rari e in bassa abbondanza. Inoltre, ci sono spesso problemi con la penetranza tissutale associata agli anticorpi che possono portare a un'osservazione e una valutazione imprecise della proteina di interesse. Inoltre, le linee di trappola proteica possono essere inserite in diversi background genetici utilizzati per determinare le funzioni dei fattori necessari per la corretta deposizione del BM come (i) metodi per manipolare l'espressione genica (ad esempio, UAS / Gal4), (ii) mutanti e (iii) linee di interferenza dell'RNA (RNAi). Infine, queste trappole proteiche possono essere utilizzate per visualizzare la localizzazione e la funzione di BM utilizzando l'imaging dal vivo⁵⁷.

Tuttavia, la fusione di un tag fluorescente in una proteina di interesse può interferire con la sua localizzazione e le sue funzioni. Pertanto, è fondamentale valutare eventuali effetti aberranti del tag sulla proteina. Un modo per garantire che l'aggiunta di un tag fluorescente non interferisca con la funzione e la localizzazione delle proteine BM è determinare se la linea transgenica Drosophila è omozigote vitale. Entrambe le linee Vkg-GFP e Pcan-GFP che vengono utilizzate nei diversi esperimenti qui descritti e in precedenza, sono omozigoti vitali, indicando che l'aggiunta di un tag GFP non interferisce con la funzione di queste proteine essenziali^29,30.

Importanza della preparazione, della fissazione e della colorazione dei tessuti per l'imaging
Per visualizzare in modo efficiente e accurato la FE, è fondamentale preparare, fissare e macchiare correttamente il tessuto ovarico come indicato in questo metodo. In primo luogo, dopo la dissezione, rimuovere con cura tutti gli altri organi e i detriti di mosca prima della fissazione. Si raccomanda l'uso di paraformaldeide (PFA) per fissare il tessuto, poiché porta alla fluorescenza GFP brillante ed è compatibile con la maggior parte degli anticorpi. Tuttavia, il PFA potrebbe non essere compatibile con tutti gli anticorpi; alcuni possono richiedere la fissazione di glutaraldeide o metanolo. Inoltre, per evitare la fluorescenza di fondo dovuta al legame non specifico dell'anticorpo primario, il tessuto ovarico deve essere incubato su un bilanciere a piattaforma nutating per almeno 1 ora in soluzione bloccante e ampiamente lavato più volte dopo l'incubazione di anticorpi primari e secondari come descritto nel protocollo. Infine, il corretto montaggio del tessuto ovarico è essenziale per ottenere un'imaging ottimale. Ciò richiede un'attenta separazione delle singole camere delle uova per evitare il loro accatastamento l'una sull'altra. È anche importante lasciare che il mezzo di montaggio polimerizzi completamente prima dell'imaging per evitare il galleggiamento del tessuto sotto il coverslip. Ciò consente inoltre al supporto di montaggio di raggiungere il suo indice di riflessione ottimale, che è molto importante per l'imaging a super-risoluzione. In caso contrario, la qualità dell'immagine verrà compromessa. Inoltre, i vetrini preparati possono essere conservati fino a 1 mese a 4 °C, prima che la fluorescenza venga estinta. Oltre al protocollo fornito, sono disponibili diversi altri protocolli per la dissezione ovarica e la colorazione 53,54,55.

L'uso di parametri di acquisizione ed elaborazione adeguati è fondamentale per l'imaging ottimale e per valutare la localizzazione delle proteine BM utilizzando l'imaging confocale e a super-risoluzione
Come descritto in precedenza, è fondamentale impostare correttamente i parametri di acquisizione per l'imaging confocale e a super-risoluzione per ottenere immagini ottimali del campione. Per l'acquisizione delle immagini, il ROI deve essere accuratamente selezionato utilizzando la funzione di zoom e quindi impostando in modo ottimale le dimensioni del fotogramma e la velocità di acquisizione. Inoltre, come illustrato nella Figura 2, è fondamentale regolare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore in modo appropriato per visualizzare il traffico intracellulare senza saturare i rivelatori. Questi parametri devono essere impostati con molta attenzione per evitare immagini sottoesposte o sovraesposte (Figura 2). Le immagini sottoesposte si tradurranno in immagini a bassa risoluzione, in cui le strutture intracellulari saranno difficili da visualizzare e caratterizzare (Figura 2B). Le immagini sovraesposte a causa della saturazione del rivelatore portano a un'interpretazione errata dei dati e a artefatti di colocalizzazione (Figura 2C). Se l'obiettivo è determinare la localizzazione vescicolare di proteine BM marcate endogenamente, la fluorescenza delle proteine marcate con GFP (ad esempio, Vkg-GFP e Pcan-GFP) nel BM basale satura rapidamente il rivelatore. Tuttavia, le vescicole contenenti meno proteine BM marcate con GFP appariranno deboli. Pertanto, è importante impostare la sensibilità dell'immagine utilizzando le strutture intracellulari contenenti BM (ad esempio, vescicole) e non sul BM (Figura 2). Anche la selezione della dimensione del foro stenopeico è molto importante. Idealmente, una dimensione stenopeica di 1 UA per ogni canale dovrebbe essere selezionata per immagini della migliore qualità, specialmente quando la risoluzione nell'asse z è importante. La dimensione del foro stenopeico più piccola è ottimale per le sezioni ottiche più sottili. Tuttavia, quando non è richiesta una risoluzione ottimale dell'asse z o non viene acquisita una pila z, la dimensione del foro stenopeico può essere aumentata per evitare il fotosbiancamento. Inoltre, per segnali molto deboli, l'aumento della dimensione del foro stenopeico può aiutare a causa di un rapporto segnale-rumore più elevato e della cattura di più fotoni, aiutando nell'interpretazione dei dati.

Per l'imaging a super-risoluzione, è necessario prestare particolare attenzione all'elaborazione della deconvoluzione per evitare di generare immagini sotto- o sovra-elaborate che sono scarsamente risolte, come illustrato nella Figura 3. Infine, per ottenere una ricostruzione 3D ottimale, si consiglia vivamente di impostare l'intervallo migliore determinato dal software. Un intervallo troppo grande tra le sezioni z (cioè superiore a 0,5 μm) porterà a una scarsa resa 3D e influenzerà la successiva analisi del fenotipo.

Vantaggio della super-risoluzione rispetto alla microscopia confocale tradizionale durante l'imaging del traffico intracellulare di BM
Come illustrato nella sezione dei risultati, sebbene la localizzazione e la distribuzione delle proteine BM possano essere valutate con precisione utilizzando l'imaging confocale, l'approccio di super-risoluzione descritto genera dati di imaging più precisi con un aumento significativo della risoluzione delle strutture intracellulari contenenti proteine BM, nonché un rapporto segnale-rumore migliorato. Inoltre, questa tecnica di microscopia a super-risoluzione è relativamente facile da usare. Poiché l'imaging a super-risoluzione aumenta significativamente la risoluzione rispetto alla microscopia confocale, fino a 120 nm negli assi x e y e 350 nm nell'asse z, questo approccio avrà un grande impatto sulla nostra comprensione della deposizione polarizzata di BM caratterizzando più accuratamente il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nelle cellule epiteliali come le FC.

Inoltre, un altro approccio di imaging a super-risoluzione (microscopia a illuminazione strutturata, SIM) e l'uso di algoritmi di deconvoluzione progettati per la microscopia confocale a scansione puntuale (cioè il modulo software a risoluzione avanzata di Nikon) sono stati utilizzati in precedenza per caratterizzare il ruolo dei fattori coinvolti nella deposizione BM²⁹. L'aumento della risoluzione associato a queste tecniche ha fornito informazioni chiave sulla nostra comprensione del traffico intracellulare di proteine BM e dell'organizzazione del BM. Tuttavia, questi approcci presentano alcune limitazioni rispetto alla microscopia Airyscan. Ad esempio, la SIM non è molto efficiente nell'acquisire immagini ottimali quando si ottengono sezioni ottiche z in profondità nel tessuto. Ciò rende la SIM difficile da utilizzare durante lo screening di nuovi componenti coinvolti nella deposizione di BM. Inoltre, l'uso di algoritmi di deconvoluzione applicati alle immagini confocali non raggiunge lo stesso livello di super-risoluzione. Nel complesso, l'imaging a super-risoluzione airyscan su tessuto fisso è un approccio potente e superiore per studiare il traffico intracellulare e la deposizione di BM.

Tuttavia, come con qualsiasi altra microscopia a super-risoluzione, anche alcuni inconvenienti sono associati a questo approccio e devono essere presi in considerazione durante l'imaging. In primo luogo, la modalità super-risoluzione di solito richiede un tempo di acquisizione più lungo del campione rispetto alla modalità confocale. Pertanto, i parametri di acquisizione e la regione di interesse devono essere impostati con attenzione per ridurre al minimo la fotosbiancamento del campione. Inoltre, i file di immagine generati dalla microscopia a super-risoluzione sono molto più grandi dei file generati dalla microscopia confocale e potrebbero richiedere computer o server specializzati per l'elaborazione e l'archiviazione delle immagini.

Infine, l'imaging dal vivo delle proteine BM durante l'oogenesi di Drosophila è stato utilizzato per caratterizzare nuovi fattori coinvolti nella polarità BM⁵⁷. Tuttavia, questo approccio ha dei limiti, in particolare nella risoluzione delle strutture intracellulari durante il traffico di proteine BM. La microscopia a super-risoluzione è un potente approccio da utilizzare in combinazione con l'imaging dal vivo per determinare con precisione i ruoli dei fattori identificati nella deposizione polarizzata delle proteine BM.

Altre applicazioni di questo metodo per studiare la localizzazione di componenti intracellulari dedicati al traffico vescicolare utilizzando proteine marcate endogenamente e imaging a super-risoluzione
La creazione e il mantenimento di tessuti e organi durante lo sviluppo e in un organismo adulto si basano in parte sulla segnalazione da cellula a cellula e sulla tensione e adesione cellulare. Questi processi dipendono dal traffico intracellulare, dall'endocitosi, dall'esocitosi e dalla secrezione di proteine specifiche. Pertanto, i metodi qui descritti per decifrare il traffico intracellulare di BM utilizzando proteine marcate endogenamente e microscopia confocale e super-risoluzione potrebbero essere facilmente adattati per studiare ciascun processo. Inoltre, la facilità d'uso dell'editing genetico mediato da CRISPR/Cas9 per generare proteine marcate endogenamente rende questo approccio ancora più versatile e potente⁵⁸.

In conclusione, abbiamo descritto metodi per la preparazione e l'imaging delle proteine BM nel FE dell'ovaio Drosophila utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione. Questi protocolli possono essere applicati per lo screening ad alto rendimento per identificare nuovi componenti dedicati al corretto posizionamento delle proteine BM. Infine, l'impiego di questa metodologia ha il potenziale per dare un contributo significativo alla nostra comprensione di come le cellule epiteliali controllano la secrezione polarizzata delle proteine BM, un processo chiave nella creazione e nel mantenimento dell'architettura epiteliale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing