Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin
Summary
Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.
Abstract
Au cours du développement des vertébrés, les cellules de la crête neurale (NCC) migrent largement et se différencient en différents types de cellules qui contribuent à des structures telles que le squelette craniofacial et le système nerveux périphérique. Bien qu’il soit essentiel de comprendre la migration des NCC dans le contexte d’un embryon 3D, l’isolement des cellules migratrices en culture 2D facilite la visualisation et la caractérisation fonctionnelle, complétant ainsi les études embryonnaires. Le présent protocole démontre une méthode pour isoler les plis neuraux crâniens des poussins afin de générer des cultures primaires de NCC. Les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux plaqués sur un substrat recouvert de fibronectine. Il en résulte des populations de CNC dispersées et adhérentes qui peuvent être évaluées par coloration et analyses morphologiques quantitatives. Cette approche de culture simplifiée est hautement adaptable et peut être combinée avec d’autres techniques. Par exemple, l’émigration NCC et les comportements migratoires peuvent être évalués par imagerie accélérée ou interrogés fonctionnellement en incluant des inhibiteurs ou des manipulations expérimentales de l’expression génique (par exemple, l’ADN, morpholino ou électroporation CRISPR). En raison de sa polyvalence, cette méthode fournit un système puissant pour étudier le développement des CNC crâniens.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire transitoire chez les embryons de vertébrés. Les NCC sont spécifiés aux bords de la plaque neurale et subissent une transition épithéliale vers mésenchymateuse (EMT) pour migrer du tube neural dorsal1. Après l’EMT, les NCC se dispersent largement dans l’embryon, se différenciant et contribuant à diverses structures, y compris le squelette craniofacial, les voies d’écoulement du cœur et la majorité du système nerveux périphérique2. Les changements dans la polarité cellulaire, le cytosquelette et les propriétés d’adhésion sous-tendent ce passage d’une population cellulaire prémigratoire à une population cellulaire migratrice3. L’étude de l’EMT NCC et de la migration fournit des informations sur les mécanismes fondamentaux de la motilité cellulaire et éclaire les efforts visant à prévenir et à traiter les malformations congénitales et les métastases cancéreuses.
Bien que l’analyse in vivo soit essentielle pour comprendre les processus de développement des CCN dans un contexte embryonnaire, les méthodes in vitro offrent une accessibilité visuelle et physique qui facilite d’autres voies expérimentales. Dans un environnement 2D simplifié, la morphologie NCC, les structures cytosquelettiques et la distance migrée peuvent être évaluées. De plus, les effets de la perturbation génétique ou des facteurs solubles sur les comportements migratoires des CCN mobiles peuvent être analysés 4,5,6,7,8,9,10. De plus, les CCN prémigratoires ou migrateurs isolés peuvent être recueillis, mis en commun et utilisés pour des méthodologies à haut débit afin d’étudier la régulation du développement des CCN par le biais du profilage protéomique, transcriptomique et épigénomique 7,11. Bien qu’il existe des méthodes pour préparer les CNC crâniennes à partir de divers organismes modèles de développement12,13,14, cet article démontre la mécanique de l’approche pour ceux qui apprennent d’abord à cultiver des NCC crâniens à partir d’embryons de poussins.
Le protocole actuel décrit une technique polyvalente pour préparer des cultures de CNC crâniennes de poussins (figure 1). Parce que les NCC migrent facilement des plis neuraux explantés sur un substrat de culture, les NCC de poussins se séparent naturellement des tissus embryonnaires et les cultures primaires sont facilement générées. Comme les NCC du mésencéphale migrent en masse à partir des plis neuraux crâniens (contrairement à la délamination prolongée cellule par cellule dans le tronc15), ces cultures sont principalement constituées de cellules de crête neurale crâniennes migratoires, l’excision initiale des plis neuraux fournissant une méthode de collecte pour les NCC prémigratoires. Une méthode de base pour disséquer et cultiver les plis neuraux crâniens des poussins est détaillée, et des suggestions pour différentes applications et variations de cette méthode sont proposées.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole de culture du pli neural crânien du poussin. (A,B) Les plis neuraux crâniens (encadrés en bleu) sont excisés d’un embryon de poussin à cinq somites (en vue dorsale en A). Bandes grises, croissant cardiaque. (C) Lorsqu’elles sont plaquées sur fibronectine, les cellules de la crête neurale migratrice émergent des plis neuraux et se dispersent sur le substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique décrite ici fournit une méthode adaptable pour isoler les plis neuraux des poussins et les plaquer pour créer des cultures de CCN crâniens migrateurs. Ces cultures fournissent des conditions 2D simplifiées pour une analyse facile de la migration et de la morphologie des NCC des poussins qui peuvent compléter les méthodes d’imagerie in ovo plus difficiles sur le plan technique24,25,26. Bien que cett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Corinne A. Fairchild et Katie L. Vermillion, qui ont participé à l’élaboration de notre version du protocole de culture des plis neuraux crâniens des poussins.
Materials
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
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