铁 (Fe) 生物利用度的 Caco-2 细胞生物测定代表了一种经济高效且用途广泛的方法,用于评估食品、食品、补充剂、膳食甚至饮食方案的铁生物利用度。经过人体研究的彻底验证,它代表了铁生物利用度研究的最新技术。
了解铁的生物利用度对于评估食品中铁的营养质量至关重要。Fe生物利用度的 体内 测量受到成本、通量和食品Fe同位素标记固有的警告的限制。因此,迫切需要一种高通量和成本效益高的方法。Caco-2细胞生物测定法就是为了满足这一需求而开发的。用于Fe生物利用度的Caco-2细胞生物测定利用模拟的胃和肠道消化以及称为Caco-2的人肠上皮细胞系的培养。在Caco-2细胞中,Fe摄取刺激铁蛋白的细胞内形成,铁蛋白是一种易于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的铁储存蛋白。铁蛋白形成与铁摄取成比例;因此,通过测量Caco-2细胞铁蛋白的产生,可以评估肠道从模拟食物消化物到肠细胞中的Fe摄取。
通过这种方法,该模型复制了确定食品铁生物利用度的关键初始步骤。自1998年成立以来,该模型方法已与已知影响人类铁生物利用度的因素进行了严格的比较。此外,它已被应用于平行研究,三项人类功效研究评估了铁生物强化作物。在所有情况下,生物测定都正确预测了因子、作物和整体饮食中铁生物利用度的相对量。本文提供了Caco-2细胞培养与 体外 消化过程和细胞铁蛋白ELISA相结合的详细方法,以进行Caco-2细胞生物测定以获得Fe生物利用度。
为了充分了解Caco-2细胞生物测定对Fe生物利用度的研究需求和益处,必须首先了解该模型出现之前的方法。测量体内食物或膳食中的Fe生物利用度是一项具有挑战性的任务,特别是当需要在膳食或饮食中评估食物组合时。在过去50年中,同位素标记一直是测量Fe生物利用度的最常见方法1。同位素标记用于单餐和多餐研究,对于长期研究是不切实际的。铁的稳定同位素如57铁和58铁是最常用的;然而,已经利用全身计数2对59Fe等放射性同位素进行了研究。对于植物性食品,同位素标记是通过外在或内在标记完成的。对于外在标记,将已知量的同位素添加到食物或膳食中。然后将食物混合,并在食用前将15-30分钟的平衡期纳入方案中。水培培养 – 将同位素添加到营养液中,以便在植物生长和发育时将其纳入植物中 – 是植物食品内在标记所必需的。下面讨论每种方法的优缺点。
外在同位素标记
在1970年代早期至中期,通过食品中Fe的外在标记来研究人类Fe的吸收,其中将已知量的同位素添加到食物或膳食中已知量的Fe中,混合,并在测量前平衡15-30分钟。已经使用了不同数量的外征同位素,范围从本征铁的1%到100%,但最常见的是在7%-30%的范围内3。外在标记基于外在Fe同位素与食物或膳食的固有Fe完全平衡的假设。然后测量外征同位素吸收,并计算外征同位素的每个原子以表示给定数量的固有Fe原子。该计算基于相对摩尔量。1983年,该技术的多项验证研究在一篇综述论文4中进行了总结。通过同时比较外征同位素标签的吸收百分比与固有同位素标记的吸收百分比来验证该技术。因此,外禀吸收与内在吸收的比率接近1表明每个Fe池被平等地吸收。当时,接近1的比率也被认为代表外在同位素与食物或膳食的内在Fe的平衡。外在与内在铁吸收的比率范围为平均值0.40至1.62,在63项比较中,平均值(±SD)比率为1.08±0.14。值得注意的是,在本综述总结的所有研究中,没有一项直接测试了外在标签与内在Fe的平衡。总之,该综述的作者得出以下结论:
“在某些实验条件下,外在标签技术已被证明对几种食物有效。但是,这种方法还不能被认为是在所有类型的食物中得到证明的。外在标签法不适用于监测含有不溶性铁形式的饮食中的铁吸收。该技术的有效性依赖于一个基本假设,即外在标签与所有内源性非血红素食物铁完全交换。目前尚不清楚不同形式的非血红素铁是如何完全被外在标签标记的。鉴于研究表明,铁抑制剂对外在标签的影响可能与食物中某些形式的非血红素铁不同,这一点很重要。对可能损害完全同位素交换的食物因子的研究很少。因此,解释来自外在标签研究的生物利用度数据需要考虑可能存在于食物或饮食中的交换抑制剂。
自1983年以来,仅发表了两项研究,评估了Fe3,5的外在标记的准确性。在这两项研究中,将外在同位素标签的平衡直接与食品的内在铁进行比较,在这些研究中,食品是主食作物。测试了白豆、红豆和黑豆品种,以及扁豆和玉米。使用已建立的体外消化技术以及Fe溶解度和沉淀的测量,两项研究都表明,外在同位素标记并不能始终如一地导致完全平衡,有证据表明,对于某些豆类品种,根据外在同位素的数量和种皮颜色3,不平衡可能非常高。尽管1983年的综述论文得出了结论,但豆类的外在标签研究仍在继续6,7,8,9,10,11,12。这些研究均未包括测试外在标签与内在Fe的平衡性。
内在标签
用于评估铁生物利用度的植物食品的内在标记消除了外在标记中平衡的准确性问题。然而,由于水培培养需要温室空间,这种方法不能产生大量材料。水培培养是劳动密集型的,需要大量昂贵的稳定同位素,并且经常导致植物生长在产量和种子铁浓度方面不同。由于成本原因,内在标记仅适用于旨在了解铁摄取机制或影响食品中铁摄取的因素的小规模研究。生产 1-2 公斤主食作物的成本约为 20,000-30,000 美元,具体取决于同位素和水培方法13,14。
鉴于与同位素标记相关的挑战,研究人员寻求开发 体外 方法。早期的方法利用模拟的胃和肠道食物,结合Fe溶解度或Fe透析性的测量作为生物利用度的估计15。这些研究很快发现,Fe透析性并不是生物利用度的一致衡量标准,因为Fe是可溶的,与化合物紧密结合,因此不可交换,导致生物利用度被高估。为了解决这些问题,进化了利用人类肠道细胞系的方法,从而增加了活组分并能够测量Fe摄取16。人类肠道细胞Caco-2细胞起源于人类结肠癌,并已广泛用于营养吸收研究。该细胞系很有用,因为在培养中,细胞分化成肠细胞,其功能类似于小肠的刷状边界细胞。研究表明,Caco-2细胞表现出适当的转运蛋白和对影响Fe摄取的因素的反应17,18。
最初的研究利用放射性同位素测量Caco-2细胞中的Fe摄取,经过改进以基于Caco-2细胞铁蛋白形成来测量Fe摄取。Caco-2 细胞铁蛋白测量提高了样品通量,并消除了放射性同位素处理和外在铁与固有铁19,20 的平衡问题。通过铁蛋白形成测量铁的摄取使研究人员能够研究广泛的食物,包括复杂的膳食21。因此,模拟(体外)消化与Caco-2细胞Fe摄取相结合,为食物中的Fe摄取提供了更好的生理评估。需要注意的是,该模型主要决定了Fe生物利用度的相对差异。像许多有用的细胞系一样,Caco-2细胞也显示出反应性的变化,但在食物之间铁摄取方面保持一致的相对差异。适当的技术和对细节的仔细关注可以改善Caco-2细胞中一致的细胞铁蛋白形成反应。
体外消化/Caco-2细胞模型也称为Caco-2细胞生物测定。通过与人类和动物研究的直接比较,该测定已得到彻底验证22。除了将生物测定与人类功效试验直接平行比较外,该模型还被证明在铁摄取方面表现出与人类相似的定性反应18,19,23。因此,作为一种体外方法,Caco-2细胞生物测定作为评估食品中铁营养的筛选工具具有很高的可信度。它已广泛应用于众多食品和食品21,24,25,26,27,28。
自 1998 年成立以来,Caco-2 细胞生物测定法已经推动了铁营养领域的发展,因为它有助于确定影响肠道铁摄取的因素。通过这样做,该模型已经制定并完善了研究目标,以实现更明确和成本更低的人体研究。人们也可以争辩说,使用该模型否定了进行某些人体试验的必要性。
总之,可以使用Caco-2细胞生物测定法测量食物或膳食中Fe的相对输送。无论测试膳食中的Fe含量如何,生物测定都定义了进入肠细胞的相对Fe量 – 吸收过程的第一步。这是定义铁生物利用度的最重要步骤,因为大多数情况下的目标是测量以改善或至少监测食品中铁的营养质量。鉴于铁状态受吸收调节,因此缺铁个体的铁摄取上调以满足营养需求,该模型的标准条件设计为细胞对铁的摄取最大。通过这种方式,生物测定提供了食物输送铁潜力的真实测量。
自成立以来,已经发表了许多研究来描述这种用于Caco-2细胞生物测定的方法。自1998年首次出版以来,基本条件基本保持不变18.然而,在过去的20年中,许多技术细节已经得到完善和标准化,以在生物测定的反应中产生前所未有的一致性。仔细和精确地坚持细胞培养和 体外 消化条件是生物测定一致和灵敏反应的关键。
根据我们培训许多人使用这种方法…
The authors have nothing to disclose.
作者对张永培和玛丽·博迪斯的技术努力深表感谢。该模型在营养领域的成功应用是他们专业知识和对细节的关注的直接结果。该模型的开发完全由美国农业部农业研究服务局资助。
0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
collagen | Corning | 354236 | |
dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
large column | VWR International | KT420400-1530 | |
Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |