El bioensayo de células Caco-2 para la medición de la biodisponibilidad de hierro en los alimentos
Summary
El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.
Abstract
El conocimiento de la biodisponibilidad del Fe es fundamental para la evaluación de la calidad nutricional del Fe en los alimentos. La medición in vivo de la biodisponibilidad de Fe está limitada por el costo, el rendimiento y las advertencias inherentes al etiquetado isotópico del Fe alimentario. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de un enfoque que sea de alto rendimiento y rentable. El bioensayo de células Caco-2 fue desarrollado para satisfacer esta necesidad. El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe utiliza la digestión gástrica e intestinal simulada junto con el cultivo de una línea celular epitelial intestinal humana conocida como Caco-2. En las células Caco-2, la captación de Fe estimula la formación intracelular de ferritina, una proteína de almacenamiento de Fe fácilmente medida mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La ferritina se forma en proporción a la captación de Fe; por lo tanto, al medir la producción de ferritina de células Caco-2, se puede evaluar la absorción intestinal de Fe de los alimentos simulados digeridos en el enterocito.
A través de este enfoque, el modelo replica el paso inicial clave que determina la biodisponibilidad de Fe de los alimentos. Desde su creación en 1998, este enfoque modelo se ha comparado rigurosamente con factores conocidos por influir en la biodisponibilidad humana de Fe. Además, se ha aplicado en estudios paralelos, con tres estudios de eficacia humana que evalúan cultivos biofortificados con Fe. En todos los casos, el bioensayo predijo correctamente las cantidades relativas de biodisponibilidad de Fe a partir de los factores, los cultivos y la dieta general. Este documento proporciona métodos detallados sobre el cultivo celular de Caco-2 junto con el proceso de digestión in vitro y el ELISA de ferritina celular necesarios para realizar el bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe.
Introduction
Para comprender completamente la necesidad de investigación y el beneficio del bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de Fe, primero se deben comprender los enfoques que existían antes del advenimiento de este modelo. La medición de la biodisponibilidad de Fe de un alimento o comida in vivo es una tarea difícil, particularmente cuando las combinaciones de alimentos deben evaluarse en una comida o dieta. El etiquetado isotópico ha sido el enfoque más común para la medición de la biodisponibilidad de Fe en los últimos 50 años1. El etiquetado isotópico se utiliza para estudios de comida única y comida múltiple y no es práctico para estudios a largo plazo. Los isótopos estables de Fe como 57Fe y 58Fe son los más utilizados; sin embargo, se han realizado estudios con radioisótopos como 59Fe, utilizando el conteo de cuerpo entero2. Para los alimentos vegetales, el etiquetado isotópico se ha realizado a través del etiquetado extrínseco o intrínseco. Para el etiquetado extrínseco, se agrega una cantidad conocida de isótopo al alimento o comida. Luego se mezcla la comida y se incorpora un período de equilibrio de 15-30 minutos en el protocolo antes del consumo. El cultivo hidropónico, agregar el isótopo a la solución nutritiva para incorporarlo a la planta mientras crece y se desarrolla, es necesario para el etiquetado intrínseco de los alimentos vegetales. Los pros y los contras de cada enfoque se discuten a continuación.
Etiquetado isotópico extrínseco
A principios y mediados de la década de 1970, la absorción humana de Fe se estudió mediante el etiquetado extrínseco de Fe en los alimentos, en el que se agrega una cantidad conocida de isótopo a la cantidad conocida de Fe en el alimento o la comida, se mezcla y se equilibra durante 15-30 minutos antes de las mediciones. Se han utilizado varias cantidades de isótopos extrínsecos, que van del 1% al 100% del Fe intrínseco, pero más comúnmente en el rango de 7% -30%3. El etiquetado extrínseco se basa en la suposición de que el isótopo extrínseco de Fe se equilibra completamente con el Fe intrínseco del alimento o la comida. Luego se mide la absorción de isótopos extrínsecos, y cada átomo del isótopo extrínseco se calcula para representar un número dado de átomos de Fe intrínsecos. Este cálculo se basa en las cantidades molares relativas. En 1983, múltiples estudios de validación de la técnica fueron resumidos en un artículo de revisión4. La validación de la técnica se realizó comparando simultáneamente el porcentaje de absorción de la etiqueta isotópica extrínseca con el porcentaje de absorción de una etiqueta isotópica intrínseca. Por lo tanto, una relación de absorción extrínseca a intrínseca cercana a 1 sugiere que cada grupo de Fe fue igualmente absorbido. En ese momento, también se consideró que una relación cercana a 1 representaba el equilibrio del isótopo extrínseco con el Fe intrínseco del alimento o la comida. Las relaciones de absorción extrínseca a intrínseca de Fe variaron de valores medios de 0,40 a 1,62, con una relación media (±DE) de 1,08 ± 0,14 en 63 comparaciones. Es importante señalar que, en todos los estudios resumidos en esta revisión, ninguno probó directamente el equilibrio de la etiqueta extrínseca con la Fe intrínseca. En resumen, los autores de la revisión concluyeron lo siguiente:
“La técnica de etiqueta extrínseca ha demostrado ser válida para varios alimentos bajo ciertas condiciones experimentales. Pero, este método aún no se puede considerar probado con respecto a todos los tipos de alimentos. El método de etiqueta extrínseca no es apropiado para monitorear la absorción de hierro de una dieta que contiene formas insolubles de hierro. La validez de esta técnica se basa en la suposición básica de que la etiqueta extrínseca intercambia completamente con todo el hierro endógeno de alimentos no hemo. En la actualidad no se sabe cuán completamente las diferentes formas de hierro no hemo están etiquetadas por una etiqueta extrínseca. Esto es importante a la luz de los estudios que han sugerido que los inhibidores de hierro pueden afectar la etiqueta extrínseca de manera diferente a algunas formas de hierro no hemo en los alimentos. La investigación sobre los factores alimentarios que pueden perjudicar un intercambio isotópico completo es escasa. Por lo tanto, la interpretación de los datos de biodisponibilidad de la investigación de etiquetas extrínsecas requiere la consideración de los inhibidores del intercambio que pueden estar presentes en el alimento o la dieta”.
Desde 1983, sólo se han publicado dos estudios que evaluaron la precisión del etiquetado extrínseco de Fe 3,5. En ambos estudios, el equilibrio de una etiqueta isotópica extrínseca se comparó directamente con el Fe intrínseco de los alimentos, que, en estos estudios, eran cultivos alimentarios básicos. Se probaron variedades de frijol blanco, rojo y negro, junto con lentejas y maíz. Utilizando técnicas establecidas de digestión in vitro y la medición de la solubilidad y precipitación de Fe, ambos estudios demostraron que el etiquetado isotópico extrínseco no resulta consistentemente en un equilibrio total, con evidencia de que, para algunas variedades de frijol, el desequilibrio puede ser muy alto dependiendo de la cantidad de isótopo extrínseco y el color de la cubierta de la semilla3. A pesar de las conclusiones del artículo de revisión de 1983, los estudios de etiquetado extrínseco de frijoles continuaron 6,7,8,9,10,11,12. Ninguno de estos estudios incluyó probar el equilibrio de la etiqueta extrínseca con el Fe intrínseco.
Etiquetado intrínseco
El etiquetado intrínseco de alimentos vegetales para la evaluación de la biodisponibilidad de Fe elimina los problemas de precisión del equilibrio en el etiquetado extrínseco. Sin embargo, este enfoque no puede producir grandes cantidades de material debido al requisito de espacio de invernadero para el cultivo hidropónico. El cultivo hidropónico requiere mucha mano de obra, requiere una gran cantidad de isótopos estables costosos y, a menudo, da como resultado un crecimiento de las plantas diferente en términos de rendimiento y concentración de Fe de la semilla. Debido al costo, el etiquetado intrínseco solo es adecuado para estudios a pequeña escala destinados a comprender los mecanismos subyacentes a la absorción de Fe o los factores que influyen en la absorción de Fe de los alimentos. La producción de 1-2 kg de un cultivo alimentario básico cuesta aproximadamente $ 20,000- $ 30,000 solo para materiales, dependiendo del enfoque isotópico e hidropónico13,14.
Dados los desafíos asociados con el etiquetado isotópico, los investigadores buscaron desarrollar enfoques in vitro. Los primeros métodos utilizaron alimentos gástricos e intestinales simulados, junto con la medición de la solubilidad de Fe o dializabilidad de Fe como una estimación de la biodisponibilidad15. Tales estudios encontraron rápidamente que la dializabilidad del Fe no era una medida consistente de biodisponibilidad, ya que el Fe puede ser soluble, estrechamente unido a los compuestos y, por lo tanto, no intercambiable, lo que lleva a la sobreestimación de la biodisponibilidad. Para abordar estos problemas, la metodología para utilizar una línea celular intestinal humana evolucionó, agregando así un componente vivo y permitiendo la medición de la absorción de Fe16. Las células intestinales humanas, las células Caco-2, se originaron a partir de un carcinoma de colon humano y se han utilizado ampliamente en estudios de absorción de nutrientes. Esta línea celular es útil ya que, en cultivo, las células se diferencian en enterocitos que funcionan de manera similar a las células de borde en cepillo del intestino delgado. Los estudios han demostrado que las células Caco-2 exhiben los transportadores apropiados y la respuesta a los factores que influyen en la captación de Fe17,18.
Los estudios iniciales, utilizando radioisótopos para medir la absorción de Fe en células Caco-2, se refinaron para medir la absorción de Fe basada en la formación de ferritina de células Caco-2. La medición de la ferritina de células Caco-2 mejoró el rendimiento de la muestra y anuló los problemas de manejo de radioisótopos y el equilibrio del Fe extrínseco con el Fe intrínseco19,20. La medición de la absorción de Fe a través de la formación de ferritina permitió a los investigadores estudiar una amplia gama de alimentos, incluidas las comidas complejas21. Por lo tanto, la digestión simulada (in vitro) junto con la absorción de Fe de células Caco-2 proporcionó una mejor evaluación fisiológica de la absorción de Fe de los alimentos. Es importante tener en cuenta que este modelo determina principalmente las diferencias relativas en la biodisponibilidad de Fe. Al igual que muchas líneas celulares útiles, las células Caco-2 también han mostrado variabilidad en la capacidad de respuesta, pero han mantenido diferencias relativas consistentes en la absorción de Fe entre los alimentos. La técnica adecuada y la cuidadosa atención al detalle pueden mejorar la respuesta consistente de formación de ferritina celular en las células Caco-2.
El modelo de digestión in vitro / células Caco-2 también se conoce como bioensayo de células Caco-2. Este ensayo ha sido validado exhaustivamente mediante comparación directa con estudios en humanos y animales22. Además de la comparación paralela directa del bioensayo con los ensayos de eficacia en humanos, se ha demostrado que este modelo exhibe una respuesta cualitativamente similar en la captación de Fe a la de los humanos18,19,23. Por lo tanto, como enfoque in vitro, el bioensayo de células Caco-2 garantiza una alta credibilidad como herramienta de detección para evaluar la nutrición de Fe de los alimentos. Se ha aplicado ampliamente a numerosos alimentos y productos alimenticios 21,24,25,26,27,28.
Desde su creación en 1998, el bioensayo de células Caco-2 ha avanzado en el campo de la nutrición de Fe, ya que ha ayudado a identificar los factores que influyen en la absorción intestinal de Fe. Al hacerlo, este modelo ha desarrollado y refinado objetivos de investigación para estudios humanos más definitivos y menos costosos. También se podría argumentar que el uso del modelo niega la necesidad de algunos ensayos en humanos.
En resumen, la entrega relativa de Fe de un alimento o comida se puede medir con el bioensayo de células Caco-2. Independientemente de la cantidad de Fe en la comida de prueba, el bioensayo define la cantidad relativa de Fe absorbida en el enterocito, el primer paso del proceso de absorción. Este es el paso más importante para definir la biodisponibilidad del Fe, ya que la mayoría de las veces el objetivo es medir con la intención de mejorar o, al menos, controlar la calidad nutricional del Fe en un alimento. Dado que el estado del hierro está regulado por la absorción, y por lo tanto la absorción de Fe está regulada al alza en individuos deficientes en Fe para satisfacer las necesidades nutricionales, las condiciones estándar del modelo están diseñadas para que la absorción de Fe por las células sea máxima. De esta manera, el bioensayo proporciona una verdadera medida del potencial del alimento para entregar Fe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde sus inicios, se han publicado numerosos estudios que describen este método para el bioensayo de células Caco-2. Las condiciones básicas se han mantenido relativamente sin cambios desde la publicación inicial en 199818. Sin embargo, en los últimos 20 años, numerosos detalles técnicos se han refinado y estandarizado para producir una consistencia sin precedentes en la respuesta del bioensayo. La adherencia cuidadosa y precisa al cultivo celular y las condiciones de digestión in vit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor está profundamente agradecido por los esfuerzos técnicos de Yongpei Chang y Mary Bodis. La aplicación extremadamente exitosa de este modelo en el campo de la nutrición es un resultado directo de su experiencia y atención al detalle. El desarrollo de este modelo fue financiado en su totalidad por el Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
Materials
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
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