O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Summary

O bioensaponenciamento celular Caco-2 para biodisponibilidade de ferro (Fe) representa uma abordagem econômica e versátil para avaliar a biodisponibilidade da Fe a partir de alimentos, produtos alimentícios, suplementos, refeições e até regimes dietéticos. Validada minuciosamente aos estudos humanos, representa o estado da arte para estudos de biodisponibilidade fe.

Abstract

O conhecimento da biodisponibilidade fe é fundamental para a avaliação da qualidade nutricional da Fe nos alimentos. A medição in vivo da biodisponibilidade fe é limitada pelo custo, throughput e as ressalvas inerentes à rotulagem isotópica do alimento Fe. Assim, existe uma necessidade crítica de uma abordagem de alto rendimento e custo-benefício. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para satisfazer essa necessidade. O bioensaio celular Caco-2 para biodisponibilidade fe utiliza digestão gástrica e intestinal simulada juntamente com a cultura de uma linha celular epitelial intestinal humana conhecida como Caco-2. Nas células de Caco-2, a absorção de Fe estimula a formação intracelular de ferritina, uma proteína de armazenamento Fe facilmente medida por ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Forma-se de ferritina proporcional à absorção de Fe; assim, medindo a produção de ferritina celular Caco-2, pode-se avaliar a absorção intestinal de Fe a partir de digestões simuladas de alimentos para o enterócito.

Através dessa abordagem, o modelo replica o passo inicial chave que determina a biodisponibilidade de Alimentos Fe. Desde sua criação, em 1998, essa abordagem modelo tem sido rigorosamente comparada a fatores conhecidos por influenciar a biodisponibilidade humana fe. Além disso, tem sido aplicado em estudos paralelos, com três estudos de eficácia humana avaliando culturas bioesforificadas da Fe. Em todos os casos, o bioensaio previu corretamente as quantidades relativas da biodisponibilidade fe dos fatores, culturas e dieta geral. Este artigo fornece métodos detalhados sobre a cultura celular Caco-2, juntamente com o processo de digestão in vitro e ferritina celular ELISA necessário para conduzir o bioensa de célula Caco-2 para biodisponibilidade fe.

Introduction

Para entender completamente a necessidade e o benefício da pesquisa da biodisponibilidade celular Caco-2 para a biodisponibilidade da Fe, é preciso primeiro entender as abordagens que estavam em vigor antes do advento desse modelo. A medição da biodisponibilidade fe a partir de um alimento ou refeição in vivo é uma tarefa desafiadora, particularmente quando combinações de alimentos precisam ser avaliadas em uma refeição ou dieta. A rotulagem isotópica tem sido a abordagem mais comum para a medição da biodisponibilidade fe nos últimos 50 anos¹. A rotulagem isotópica é usada para estudos de refeição única e múltiplas refeições e é impraticável para estudos de longo prazo. Isótopos estáveis de Fe como ⁵⁷Fe e ⁵⁸Fe são os mais utilizados; no entanto, estudos têm sido realizados com radioisótopos como ⁵⁹Fe, utilizando a contagem de corpo inteiro². Para alimentos vegetais, a rotulagem isotópica tem sido feita através de rotulagem extrínseca ou intrínseca. Para rotulagem extrínseca, uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à comida ou refeição. O alimento é então misturado, e um período de equilíbrio de 15-30 min é incorporado ao protocolo antes do consumo. A cultura hidropônica que adiciona o isótopo à solução de nutrientes para incorporá-lo na planta enquanto ela cresce e se desenvolve – é necessária para a rotulagem intrínseca de alimentos vegetais. Os prós e contras de cada abordagem são discutidos abaixo.

Rotulagem isotópica extrínseca
No início da década de 1970, a absorção de Fe humano foi estudada pela rotulagem extrínseca de Fe em alimentos, onde uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à quantidade conhecida de Fe na comida ou refeição, misturada e equilibrada por 15-30 minutos antes das medições. Várias quantidades de isótopos extrínsecos têm sido utilizadas, variando de 1% a 100% do Fe intrínseco, mas mais comumente na faixa de 7%-30%³. A rotulagem extrínseca baseia-se no pressuposto de que o isótopo fe extrínseco fica totalmente equilibrado com o Fe intrínseco da comida ou refeição. A absorção de isótopos extrínsecos é então medida, e cada átomo do isótopo extrínseco é calculado para representar um determinado número de átomos fe intrínsecos. Este cálculo é baseado nas quantidades relativas molares. Em 1983, múltiplos estudos de validação da técnica foram resumidos em artigo^{de revisão 4}. A validação da técnica foi feita comparando simultaneamente a absorção percentual do rótulo isotópico extrínseco à absorção percentual de um rótulo isotópico intrínseco. Assim, uma razão da absorção extrínseca para intrínseca próxima a 1 sugere que cada piscina de Fe foi igualmente absorvida. Na época, também foi considerada uma relação próxima a 1, representando o equilíbrio do isótopo extrínseco com o Fe intrínseco da comida ou refeição. As razões de absorção fe extrínseca à intrínseca variaram de valores médios de 0,40 a 1,62, com razão média (±SD) de 1,08 ± 0,14 em 63 comparações. É importante notar que, em todos os estudos resumidos nesta revisão, nenhum testou diretamente o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco. Em resumo, os autores da revisão concluíram o seguinte:

“A técnica de etiqueta extrínseca tem se mostrado válida para vários alimentos em determinadas condições experimentais. Mas, esse método ainda não pode ser considerado comprovado em relação a todos os tipos de alimentos. O método de etiqueta extrínseca não é apropriado para monitorar a absorção de ferro a partir de uma dieta que contém formas insolúveis de ferro. A validade desta técnica baseia-se no pressuposto básico de que a tag extrínseca troca completamente com todo ferro alimentar não-hemo endógeno. No momento, não se sabe como completamente as diferentes formas de ferro não-heme são rotuladas por uma tag extrínseca. Isso é importante à luz de estudos que sugerem que os inibidores de ferro podem afetar a etiqueta extrínseca de forma diferente de algumas formas de ferro não-heme nos alimentos. Pesquisas sobre fatores alimentares que podem prejudicar uma troca isotópica completa são escassas. Assim, a interpretação dos dados de biodisponibilidade da pesquisa de etiquetas extrínsecas requer a consideração de inibidores de troca que possam estar presentes na alimentação ou na dieta.”

Desde 1983, foram publicados apenas dois estudos que avaliaram a exatidão da rotulagem extrínseca de Fe ^3,5. Em ambos os estudos, o equilíbrio de um rótulo isotópico extrínseco foi diretamente comparado com o Fe intrínseco dos alimentos, que, nesses estudos, eram culturas alimentares básicas. Foram testadas variedades de feijão branco, vermelho e preto, juntamente com lentilhas e milho. Utilizando técnicas de digestão in vitro estabelecidas e a medição da solubilidade e precipitação de Fe, ambos os estudos demonstraram que a rotulagem isotópica extrínseca não resulta consistentemente em equilíbrio total, com evidências de que, para algumas variedades de feijão, a misequilibração pode ser muito alta dependendo da quantidade de isótopo extrínseco e da cor^{do casaco de sementes 3}. Apesar das conclusões do artigo de revisão de 1983, os estudos de rotulagem extrínseca de feijão continuaram^em 6,7,8,9,10,11,12. Nenhum desses estudos incluiu testar o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco.

Rotulagem intrínseca
A rotulagem intrínseca de alimentos vegetais para a avaliação da biodisponibilidade fe elimina as questões de precisão do equilíbrio na rotulagem extrínseca. No entanto, essa abordagem não pode produzir grandes quantidades de material devido à exigência de espaço de estufa para a cultura hidropônica. A cultura hidropônica é intensiva em mão-de-obra, requer uma alta quantidade de isótopo estável caro, e muitas vezes resulta em crescimento vegetal diferente em termos de produção e concentração de sementes Fe. Devido ao custo, a rotulagem intrínseca só é adequada para estudos de pequena escala que visam compreender mecanismos subjacentes à absorção de Fe ou fatores que influenciam a absorção de Fe dos alimentos. A produção de 1-2 kg de uma cultura de alimentos básicos custa aproximadamente US $ 20.000-US $ 30.000 apenas para materiais, dependendo do isótopo e abordagem hidropônica^13,14.

Dado os desafios associados à rotulagem isotópica, os investigadores procuraram desenvolver abordagens in vitro. Os métodos iniciais utilizaram alimentos gástricos e intestinais simulados, juntamente com a medição da solubilidade fe ou dialyzabilidade fe como estimativa de biodisponibilidade¹⁵. Tais estudos rapidamente descobriram que a dialise fe não era uma medida consistente de biodisponibilidade, pois Fe pode ser solúvel, firmemente ligado a compostos e, portanto, não trocável, levando à superestimação da biodisponibilidade. Para lidar com essas questões, evoluiu a metodologia de utilização de uma linha celular intestinal humana, adicionando assim um componente vivo e permitindo a medição da captação de Fe¹⁶. As células intestinais humanas-Caco-2 foram originadas de um carcinoma de cólon humano e têm sido amplamente utilizadas em estudos de absorção de nutrientes. Esta linha celular é útil, pois, na cultura, as células se diferenciam em enterócitos que funcionam de forma semelhante às células fronteiriças do intestino delgado. Estudos mostram que as células Caco-2 apresentam os transportadores apropriados e resposta a fatores que influenciam a absorção^{de Fe 17,18}.

Os estudos iniciais, utilizando radioisótopos para medir a absorção de Fe em células Caco-2, foram refinados para medir a absorção de Fe com base na formação de ferritina celular Caco-2. A medição da ferritina celular Caco-2 aumentou o rendimento da amostra e negou questões de manuseio de radioisótopos e o equilíbrio da Fe extrínseca com fe intrínseco^19,20. A medição da absorção de Fe através da formação de ferritina permitiu aos pesquisadores estudar uma ampla gama de alimentos, incluindo refeições complexas²¹. Assim, a digestão simulada (in vitro) juntamente com a absorção fe celular Caco-2 proporcionou uma melhor avaliação fisiológica da absorção fe dos alimentos. É importante notar que este modelo determina principalmente diferenças relativas na biodisponibilidade fe. Como muitas linhas celulares úteis, as células Caco-2 também mostraram variabilidade na responsividade, mas mantiveram diferenças relativas consistentes na absorção de Fe entre os alimentos. A técnica adequada e a atenção cuidadosa aos detalhes podem melhorar a resposta consistente da formação de ferritina celular nas células Caco-2.

O modelo de célula in vitro/Caco-2 também é conhecido como bioensaio celular Caco-2. Este ensaio foi minuciosamente validado por meio de comparação direta com estudos humanos e animais²². Além da comparação paralela direta do bioensativo aos ensaios de eficácia humana, este modelo tem mostrado uma resposta qualitativamente semelhante na absorção de Fe à de humanos 18,19,23. Portanto, como abordagem in vitro, o bioensa de células Caco-2 garante alta credibilidade como ferramenta de triagem para avaliação da nutrição fe a partir de alimentos. Tem sido amplamente aplicado a inúmeros alimentos e produtos alimentícios 21,24,25,26,27,28.

Desde sua criação, em 1998, o bioensaio celular Caco-2 avançou no campo da nutrição fe, pois ajudou a identificar fatores que influenciam a absorção intestinal do Fe. Ao fazê-lo, esse modelo desenvolveu e refinou os objetivos de pesquisa para estudos humanos mais definitivos e menos dispendiosos. Pode-se também argumentar que o uso do modelo nega a necessidade de alguns testes em humanos.

Em resumo, a entrega relativa de Fe de um alimento ou refeição pode ser medida com o bioensaio celular Caco-2. Independentemente da quantidade de Fe na refeição de teste, o bioensaio define a quantidade relativa de Fe levada para o enterócito – a primeira etapa do processo de absorção. Este é o passo mais importante na definição da biodisponibilidade fe, pois na maioria das vezes o objetivo é medir com a intenção de melhorar ou, no mínimo, monitorar a qualidade nutricional de Fe em um alimento. Dado que o estado do ferro é regulado pela absorção e, portanto, a absorção de Fe é regulada em indivíduos deficientes fe para atender às necessidades nutricionais, as condições padrão do modelo são projetadas para que a absorção fe pelas células seja máxima. Dessa forma, o bioensaio fornece uma verdadeira medida do potencial do alimento para entregar Fe.

Protocol

NOTA: Como ponto de referência conveniente para os leitores, a seguinte metodologia descreve as condições de cultura específicas e materiais necessários para a medição da biodisponibilidade fe a partir de 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade necessários, em uma execução do bioensaio. O aumento do número de amostras além dessa capacidade não é recomendado devido ao tempo necessário para várias culturas celulares e etapas de digestão in vitro dentro do bioensaio. <p clas…

Representative Results

Identificação e medição da biodisponibilidade de Fe em culturas de alimentos básicosUma das principais razões para o desenvolvimento desse modelo foi identificar fatores que influenciam a biodisponibilidade da Fe nas culturas alimentares básicas e fornecer uma ferramenta para os criadores de plantas que lhes permitiriam identificar e desenvolver variedades com biodisponibilidade fe aprimorada. O feijão comum (Phaseolus vulgaris) tem sido alvo globalmente como uma cultura para a biofo…

Discussion

Desde sua criação, inúmeros estudos foram publicados que descrevem este método para o bioensaio celular Caco-2. As condições básicas permaneceram relativamente inalteradas desde a publicação inicial em 1998¹⁸. No entanto, nos últimos 20 anos, inúmeros detalhes técnicos foram refinados e padronizados para produzir consistência sem precedentes na resposta ao bioensaio. A adesão cuidadosa e precisa à cultura celular e às condições de digestão in vitro são a chave para a r…

Materials

0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water			Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt	Sigma Aldrich Co	T6397
6-well plates	Costar	3506	Use for bioassay experiments
ascorbic acid	Sigma Aldrich Co	A0278
bile extract	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 cells	American Type Culture Collection	HTB-37	HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225	Falcon	353138
Cell culture flasks T25	Corning	430639
Cell culture flasks T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen	Corning	354236
dialysis membrane	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Gibco	12100046	DMEM
epidermal growth factor	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit	Eagle Biosciences	FRR31-K01
fetal bovine serum	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
Hydrocortisone-Water Soluble	Sigma Aldrich Co	H0396
insert ring	Corning Costar	not sold	Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
large column	VWR International	KT420400-1530
Minimum Essential Medium	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
pancreatin	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES disodium salt	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin	Sigma Aldrich Co	P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit	Bio-Rad Laboratories Inc	Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116	Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233
Sodium selenite	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific